中藥化學教研實踐體會商榷
——以土牛膝物質基礎研究為例

歐陽文，張 恒，王玉鳳，韓 越，王雄龍，裴 剛，何桂霞

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300；3.湖南時代陽光博士后科研流動站協(xié)作研發(fā)中心，湖南 永州 410116）

“中藥化學”是指在中醫(yī)藥理論指導下，結合臨床用藥經(jīng)驗，運用現(xiàn)代的科學理論和技術研究中藥化學成分的學科[1]。 該學科通過研究中藥藥效物質基礎來探索中藥發(fā)揮藥效的化學成分，從而構建中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學的橋梁，加快推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化[2]。

在中藥化學的教學過程中，有部分師生對該課程還存在一定的理解誤區(qū)，容易導致錯誤的思維定式。 因此，不論是教師還是學生，僅掌握書本理論是遠遠不夠的，必須不斷學習該領域的新發(fā)展、新動態(tài)，通過科研工作積累的知識和經(jīng)驗，補充和豐富該課程的教學內容，從而能更好地教好該門課程。 課題組在土牛膝的物質基礎研究實踐中獲得了很多有意義的知識，并成功將科研成果運用到中藥化學的理論教學之中，取得了較好成效，現(xiàn)從成分提取、分離、鑒定等方面進行交流。

1 成分提取的教研體會

中藥化學的提取方法有多種，在平時提取中運用最多的方法仍然是溶劑提取法，該方法運用的是“相似相溶”的原理，即成分與溶劑兩者的極性越相近，則溶解度更大[3]。 如提取皂苷類化合物，因極性較大，一般推薦采用甲醇或70%乙醇進行提取。

土牛膝主要的物質基礎是皂苷類，然而在實踐中發(fā)現(xiàn)采用100%乙醇提取、70%乙醇提取或熱水煎煮，很難有效提取出總皂苷，通過實踐發(fā)現(xiàn)，30%～50%乙醇提取的總皂苷提取率可達到2%。 另外，因土牛膝主要為酸性皂苷，含醇溶劑中加入適當?shù)臍溲趸浀葔A性物質，提取效率更高。 在提取、濃縮時，土牛膝皂苷類成分很容易析出，析出物若再采用30%～50%乙醇進行溶解時則難以溶解，在實踐中探索發(fā)現(xiàn)，正丁醇-甲醇-水系統(tǒng)具有較好的溶解能力。 本文擬通過該案例說明，將科研實踐知識與教科書理論相結合，探索出最優(yōu)的提取條件。

2 化合物分離的教研體會

2.1 結晶的化合物可能是混合物

結晶和重結晶是利用溫度或溶劑不同引起化合物溶解度的改變，通過析出晶體，從而達到分離純化物質的目的，是中藥有效成分分離最重要的一種方法[4-5]。 在實踐教學中，有相當多的同學誤認為結晶就是純化合物，應該指明的是，結晶雖一般是同種分子定向排列，但也可以是同類分子的定向排列，因此，析出的晶體仍然有可能是混合物。

在近期研究中，本課題組對土牛膝中低極性組分進行分離，獲得了菠菜甾醇類混合結晶。 通過對該晶體進行高效液相色譜分析，可見3 個不同保留時間的色譜峰，進一步經(jīng)過制備液相色譜分離和核磁共振波譜法鑒定，3 個峰分別鑒定為菠菜甾醇、7，8-二氫菠菜甾醇、22，23-二氫菠菜甾醇，具體結構如圖1 所示。 從結構上看，3 種菠菜甾醇分子的結構極其類似，僅存在雙鍵位置和數(shù)量的差異，容易共同析出結晶。

圖1 3 種菠菜甾醇結構

2.2 低極性化合物宜采用反相色譜分離

一般極性偏小的化合物或中極性的化合物，中藥化學教材推薦采用硅膠或氧化鋁吸附層析法分離，原理是利用化合物的極性差異，選擇合適的洗脫溶劑，讓被分離成分在流動相和固定相之間進行連續(xù)多次的吸附與解析吸附，從而達到分離目的[6]。 通過實踐發(fā)現(xiàn)，能夠被固定相保留是能否使用該種方法分離的最重要依據(jù)。 硅膠和氧化鋁均為極性吸附劑，對極性很小的化合物沒有保留差異，因此分離效果并不理想。

仍以圖1 中3 種菠菜甾醇混合結晶的分離為例。在實踐中采用硅膠柱層析分離，無論硅膠是否活化及采用哪種溶劑系統(tǒng)洗脫分離，3 種物質之間均沒有保留差異，因此沒有明顯分離效果。相反，C18反向色譜柱對小極性化合物的吸附能力較強[7]，上述3種菠菜甾醇混合結晶可以被C18反向填料牢牢吸附，雖然用純甲醇或純乙腈都很難洗脫下來，但通過摸索，在乙腈或甲醇中添加少許異丙醇（具體見后續(xù)制備液相色譜條件），3 種菠菜甾醇混合結晶的分離度明顯得到優(yōu)化，達到滿意的分離效果。

2.3 極性較大的皂苷類化合物宜采用正相硅膠色譜分離

皂苷是一類極性偏大的化合物，教材所介紹的具體分離方法包括反相色譜、正相硅膠柱色譜等，尤其現(xiàn)代研究認識到反相色譜因其具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在皂苷的分離分析方面應用廣泛[8-9]。

課題組分離土牛膝皂苷類化合物時，首先采用了反相硅膠柱色譜進行分離，雖然可以達到一定的分離效果，卻存在著吸附力不牢固、易串點、分離度差等缺點。 根據(jù)被分離化合物能否被固定相保留這一依據(jù)，改用正相硅膠柱色譜來分離，因硅膠是強極性吸附劑，皂苷類化合物的極性也比較大，因此應增大洗脫劑極性，通過摸索取得了一定研究進展，以土牛膝酸性皂苷竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為例，最終確定分離條件為正相硅膠柱層析分離，乙酸乙酯∶88%甲酸水溶液（體積比為20∶1），通過兩次硅膠柱分離，從皂苷混合物中獲得了竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的針狀結晶。

2.4 制備液相色譜應用心得

制備液相色譜是指采用液相色譜技術制備純物質，即分離收集一種或多種物質，是中藥有效成分分離最有效的一種手段。 制備液相色譜中的“制備”這一概念指獲得一定量的單一化合物，但實驗用制備色譜儀一次能分離的化合物量太少，因此，常規(guī)正相、反相柱色譜能分離的情況下，則不宜采用制備液相進行分離。 且當樣品還很復雜時，不建議直接進行制備分離。

使用制備液相色譜時，首先需保證樣品盡可能純凈，或樣品只含兩至三個單體化合物。 另外，制備液相色譜流動相條件的摸索非常重要，由于樣品中可能存在結構相似的化合物，因此對流動相條件的要求極其苛刻。 以土牛膝中3 種菠菜甾醇類混合結晶為例，通過不斷摸索得出最佳制備方法為：YMCPack ODS-A 半制備色譜柱（日本YMC 公司，10 mm×250 mm，5 μm 粒徑），乙腈：異丙醇（體積比為2.1∶0.9），每次進樣0.1 mL，檢測波長205 nm。 3 種菠菜甾醇的高效液相色譜圖，如圖2 所示。

圖2 3 種菠菜甾醇混合晶體樣品的高效液相色譜圖

3 化合物結構鑒定的教研體會

3.1 氫譜可用于化合物純度分析

核磁共振氫譜可以對化合物中不同化學環(huán)境的氫原子進行判別，用來確定分子結構。 值得注意的是，氫譜中峰的面積與所含氫的個數(shù)成正比關系，因此，可以通過分析氫譜來判斷化合物純度。

圖3 為前文所述的菠菜甾醇類混合結晶的氫譜圖，由圖可見，在化學位移0.80～0.90 的區(qū)間，各峰之間的峰面積比例不合理，以最高場δH0.559 3、0.574 1兩個峰為例，根據(jù)氫譜知識，該兩峰顯然各自為甲基，兩者峰面積之比為2.19∶2.65，提示分子不純。對混合結晶制備分離后的氫譜見圖4。 通過對比可以看出，分離純化之后的氫譜更加合理， 最高場之處只有1個δH0.575 2 的甲基峰，其他各峰之間的峰面積也成比例，說明化合物已經(jīng)純化。

圖3 混合結晶的氫譜圖

圖4 菠菜甾醇（分離后峰1）的氫譜圖

3.2 碳譜解析中重視類似化學結構碳譜數(shù)據(jù)的收集

不同于化學合成分子的結構鑒定，有機合成中，起始的原料都是已知的，還可通過反應的原理推測最終產(chǎn)物分子的結構，然而對于天然分子，即使是已知化合物，包括結構類型、取代基等結構信息仍是有限度的，因此，中藥活性成分鑒定是中藥化學教學的重點和難點。 碳譜是一種重要的結構鑒定的波譜手段，可以給出有機化合物包括季碳在內的“骨架”信息，以及判斷分子是否對稱，并具有分辨率高的特點。

碳譜中，取代基具有位移效應，增加或減少一個取代基，一般對碳譜中α-C、β-C、γ-C 的影響較大，尤以直接相連的α-C 變化最大，但δ-C 及以上的化學位移值變化就不明顯了。換言之，取代基位移效應主要影響的是局部碳化學位移值，因此，掌握收集更多種類似結構的碳譜數(shù)據(jù)在碳譜解析中具有重要的意義。實踐中可將未知化合物的碳譜與相似模型化合物碳譜數(shù)據(jù)比較，數(shù)據(jù)相同部分的結構也應該一致，不同的碳譜數(shù)據(jù)，可能是由差異取代基所產(chǎn)生。

例如，土牛膝中竹節(jié)參皂苷Ⅰ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯3 種皂苷類的化學結構和碳譜數(shù)據(jù)分別見圖5、表1。 比較竹節(jié)參皂苷Ⅰ和竹節(jié)參皂苷Ⅳa，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 是竹節(jié)參皂苷Ⅰ中C-3羥基葡糖糖醛酸苷化，因此，其C-3 化學位移相比竹節(jié)參皂苷Ⅰ變化較大，相鄰位點的C-2 和C-4 化學位移也有一定變化，其余位置碳譜數(shù)據(jù)變化不大。竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯是在竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的Glu-6 上羧基丁酯基化，因此，其碳譜數(shù)據(jù)中Glu-6 碳的化學位移相比于竹節(jié)參皂苷Ⅳa 具有較大變化，而對其他距離取代基較遠碳原子的化學位移影響較小或無。

表1 土牛膝中3 種相似皂苷譜學數(shù)據(jù)（150 MHz，δ ppm）

圖5 土牛膝中3 種皂苷類化合物的化學結構

同種植物中次生代謝產(chǎn)物都有相似的生物合成路徑，或者不同次生代謝產(chǎn)物生物合成過程是相互關聯(lián)的，因此，在中藥活性成分結構鑒定時，應該重視類似結構的收集，掌握同一植物中一些基本母核的碳譜數(shù)據(jù)，并把他們當成模型化合物，通過取代基位移效應，可以有效幫助鑒定未知化合物結構。

4 生源途徑教學方面的體會

中藥有效成分一般指的是次生代謝產(chǎn)物，教學實踐中，學生掌握次生代謝產(chǎn)物的生源合成途徑有重要意義。 首先，生源合成途徑是初級代謝物和次級代謝物聯(lián)系的紐帶。 其次，生源合成途徑可以將天然產(chǎn)物復雜多變的化學結構串聯(lián)起來，使之成為一個有機的整體。

大家熟悉的牛膝主要是指懷牛膝Achyranthes bidentata Blume 和川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，土牛膝來源廣泛而復雜，包括莧科植物粗毛牛膝Achyranthes aspera L.、柳葉牛膝Achyranthes longifolia(Makino) Makino、鈍葉土牛膝Achyranthes aspera var. indica 及牛膝野生種Achyranthes bidentata Blume 等的干燥根及根莖[10]，課題組主要研究的是粗毛牛膝Achyranthes aspera L.。 懷牛膝、粗毛牛膝、柳葉牛膝、野生牛膝等來源于莧科牛膝屬植物，故其中應該含有相同成分，經(jīng)過課題研究及文獻調研分析表明，莧科牛膝屬植物主要成分為三萜皂苷類化合物及甾酮類化合物，其主要共有甾酮類化學成分見表2[11]。 《中華人民共和國藥典》還收錄了另一種川牛膝，為莧科杯莧屬川牛膝Cyathula officinalis Kuan 的干燥根，懷牛膝與川牛膝質量控制標志物分別為β-蛻皮甾酮與杯莧甾酮[12]，兩者功效大致相同，但懷牛膝偏于補肝腎、強筋骨，而川牛膝偏于活血化瘀。 川牛膝中甾酮類化合物結構與牛膝存在明顯差異，如表3 所示。

對比表2 與表3 可見，懷牛膝和川牛膝甾酮類化合物結構中有相同點，如A/B 環(huán)均為順式稠合、B/C、C/D 環(huán)均為反式稠合、B 環(huán)上有α，β 不飽和酮。兩種牛膝亦存在顯著差異，如懷牛膝等在C-17 上的取代基大多是鏈狀結構，而川牛膝的取代基則多含內酯環(huán)狀結構。由此可見，懷牛膝與川牛膝雖同為莧科植物，但其屬種的不同，次生代謝路徑不一致，造成了其甾酮類化合物中結構的差異。 甾酮類化合物是懷牛膝和川牛膝的主要活性物質之一，因此，兩者的功效差異可能與上述的結構差異有關。

表2 莧科牛膝屬植物主要甾酮類成分

表3 莧科杯莧屬主要甾酮類成分

5 討論

教而不研則淺，研而不教則空。科研是促進教師專業(yè)化發(fā)展的有效途徑，教學則是對教師知識的傳承與發(fā)展，因此科研與教學兩者密切相關。 在中藥化學的教學過程中，可以將自身的科研體會融入到日常教學當中，不僅能提高學生對課程學習的興趣，同時教師也能借教學促進自身的專業(yè)成長，在教與學的過程中不斷提高學術水平。 近年來，不少高校對中藥化學實驗課程的教學進行了改革方式的探索，以期提高中藥學專業(yè)學生綜合素質與中藥化學教學質量[13-16]。

結構鑒定歷來是中藥化學教學的重點和難點，同時也是學生能否學好中藥化學的關鍵環(huán)節(jié)。 中藥分子的結構鑒定技術主要包括紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振光譜、質譜和X-ray 晶體衍射等。 核磁共振碳譜中，不論是簡單的有機小分子，還是復雜的中藥分子，基于化學位移比較策略是鑒定平面結構、相對構型或者結構片段的重要手段，通過與文獻報道的結構或者結構片段進行化學位移比較，若核磁數(shù)據(jù)相同，未知化合物或者其中的結構片段則與比較對象具有相同的結構。 以本文所討論的土牛膝中竹節(jié)參皂苷Ⅰ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 丁酯3 種皂苷類的化學結構和碳譜數(shù)據(jù)兩兩比較分析為例，與類似結構碳譜數(shù)據(jù)比較進行未知化合物的結構鑒定是十分重要的一種手段，值得今后在教學和科研工作中廣泛推廣。

綜上，本課題組結合多年來在中藥化學方面實踐的內容，對中藥化學中成分提取、化合物分離以及結構鑒定等知識進行了心得體會的交流，希望利用從實踐中探索出來的經(jīng)驗加深學生對中藥化學的理解，提升中藥學專業(yè)學生的綜合素質。