兒童碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌感染的臨床特征及分子流行研究

葉龍 張莉滟 趙越 顧兵 吳渚 彭永正,4

（1.南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，廣東廣州 510280；2.廣東省人民醫院檢驗科/廣東省醫學科學院，廣東廣州 510080；3.南方醫科大學珠江醫院兒科重癥監護室，廣東廣州 510280；4.南方醫科大學珠江醫院輸血科，廣東廣州 510280）

近年來，隨著各種抗菌藥物的廣泛應用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的檢出不斷上升，給臨床抗感染治療與醫院感染防控帶來巨大挑戰，在世界范圍內造成嚴重后果，2019年美國疾病預防控制中心最新的抗生素耐藥性報告中，CRE仍是最緊迫問題［1-2］。兒童和新生兒因免疫力低下、用藥局限等原因，更易導致CRE暴發流行，但目前現有研究多以成人為主，兒童群體相關數據尚不充分［3］。本研究旨在對廣東省人民醫院2018年1月至2021年6月兒童CRE感染情況進行分析，明確其耐藥特性與分子流行特征，為對其有效防控及科學預判流行趨勢提供依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

參照中國兒童細菌耐藥監測組標準［4］，本文將≤14歲患兒納入研究范圍。回顧性分析廣東省人民醫院2018年1月至2021年6月住院患兒的相關臨床資料及感染情況，共獲得非重復菌株腸桿菌目細菌1 098株。按照全國臨床檢驗操作規程［5］，對菌株進行相關實驗。

1.2 試劑與儀器

哥倫比亞血瓊脂與M-H瓊脂培養基購自廣州迪景公司；藥敏紙片購自英國OXOID公司；PCR引物由TaKaRa公司合成，1×T3 Super PCR Mix及DNA Marker（DL-2000）購自擎科生物科技有限公司。VITEK MS微生物質譜檢測系統與VITEK 2 Compact微生物鑒定儀及相關試劑購自法國梅里埃公司；PCR擴增儀購自美國ABI公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司；凝膠成像系統購自美國Bi o-Rad公司。

1.3 質控菌株

大腸埃希菌ATCC 8739與ATCC 25922、陰溝腸桿菌ATCC 700323由廣東省臨床檢驗中心提供。

1.4 菌株鑒定與藥敏試驗

用配套儀器對部分細菌進行鑒定及藥敏復核試驗，采用M-H瓊脂培養基行紙片擴散法驗證厄他培南、亞胺培南、美羅培南的藥敏情況，其中任何1種藥物耐藥，即可確定為CRE菌株。紙片擴散法操作及相關藥敏結果的判讀參照美國臨床實驗室標準化委員會M100-S32標準［6］，頭孢哌酮/舒巴坦藥敏結果的判讀參照美國臨床實驗室標準化委員會M100-S32腸桿菌目細菌對頭孢哌酮的折點標準［6］。

1.5 CRE初篩與確證試驗

對CRE菌株采用改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）檢測碳青霉烯酶，并聯合EDTA改良碳青霉烯滅活試 驗 （EDTA-modified carbapenem inactivation method，eCIM）檢測金屬酶，進行初篩試驗。隨后提取菌株基因組DNA，采用PCR法檢測菌株所攜帶碳青霉烯酶耐藥基因情況（引物設計參照相關文獻［7-8］，引物序列見表1），PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統顯像并觀察結果。再將PCR擴增后產物送擎科生物科技有限公司測序，測序結果經基本局部比對搜索工具BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析，確定所測菌株攜帶的的耐藥基因。

表1 碳青霉烯酶主要檢測的耐藥基因引物序列

1.6 統計學分析

采用WHONET 5.6及SPSS 26.0軟件對數據進行分析。計數資料采用例數或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒一般資料

1 098株腸桿菌目細菌中共檢出CRE 66株，檢出率為6.01%。66株CRE來自66例患兒，其中男37例（56%），女29例（44%）。年齡2 d至14歲，其中<1月齡16例（24%），1月齡~28例（42%），12月齡~11例（17%），>36月齡11例（17%）。住院中位時間32 d，CRE分離中位時間為入院后第12天。伴有基礎疾病主要為呼吸道疾病（57例，86%）、心血管疾病（46例，70%）、消化道疾病（12例，18%）及腎臟疾病（10例，15%）等。多數患兒伴侵襲性操作，如氣管插管（56例，85%）、手術（48例，73%）、靜脈插管（41例，62%）、尿道插管（37例，56%）及穿刺引流（31例，47%）等。預后情況：治愈45例（68%），好轉回所在地繼續治療14例（21%），死亡7例（11%），其中兒科重癥監護室5例，新生兒科和兒童血液科各1例。死亡患兒患有急性胃腸炎、肺膿腫伴有肺炎、白血病、梗阻性腦積水、先天性心臟畸形等不同程度基礎疾病，死因包括感染性休克2例、先天性心臟病2例、重癥肺炎1例、血液病1例、腦腫瘤1例。

2.2 標本與科室分布

66株CRE主要在呼吸道、中段尿、血液標本中被檢出；被檢出CRE的患兒主要來自新生兒科、兒科重癥監護室、兒童血液科、心外科重癥監護室等科室。見圖1。

圖1 CRE的標本類型和科室分布 左圖為標本類型分布（n=66）；右圖為科室分布（n=66）。

2.3 致病菌分布

66株CRE中，肺炎克雷伯菌45株（68%）、大腸埃希菌12株（18%）、陰溝腸桿菌6株（9%）、黏質沙雷菌2株（3%）、產氣腸桿菌1株（2%）。其中，新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠）疫情發生前（2018~2019年）檢出CRE 47株，檢出率為6.5%（47/723）；新冠疫情發生后（2020~2021年）檢出CRE 19株，檢出率為5.1%（19/375）。雖然新冠疫情后住院患兒CRE的檢出率低于新冠疫情前，但差異無統計學意義（χ2=0.899，P=0.343）。

2.4 主要CRE菌株藥敏情況

66株CRE菌株對碳青霉烯類（亞胺培南、厄他培南）、青霉素復方制劑（氨芐西林/舒巴坦）、部分頭孢類（頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦）抗菌藥物高度耐藥，對常見抗菌藥物（氨曲南、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素）耐藥性普遍偏高，僅對阿米卡星（14%）、左旋氧氟沙星（23%）、妥布霉素（33%）等耐藥率相對較低，見表2。

表2 CRE感染患兒主要致病菌的耐藥率 ［株（%）］

2.5 主要CRE的碳青霉烯酶耐藥基因分析

PCR結果顯示，45株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM（20株，44%）、blaIMP（10株，22%）及blaKPC（5株，11%）為主；12株大腸埃希菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM為主（10株，83%）。測序結果經BLAST比對，blaNDM-124株，blaNDM-56株，blaIMP-45株，blaKPC-23株，仍有尚未明確基因型，有待進一步研究。

3 討論

CRE感染給公共衛生防控帶來嚴峻挑戰，據中國細菌耐藥監測網數據顯示［9］：肺炎克雷伯菌對亞胺培南與美羅培南的耐藥率從2005年的3.0%、2.9%持續上升至2018年的25.0%、26.3%，雖然2019年和2020年呈下降趨勢，但2021年又有回升。兒童尤其新生兒因免疫力低下、用藥局限等原因，CRE的檢出率高于成人，且易引起流行。多項研究表明，臨床分離的肺炎克雷伯菌在兒科病房有顯著增高趨勢，且兒童醫院CRE的分離率要高于綜合性醫院［10-12］。

本研究中CRE菌株的檢出率為6.01%，與報道［13］一致。據中國兒童細菌耐藥監測組數據［13-14］，2020年兒童CRE總體檢出率為4.9%，低于2019年的8.2%，均低于同時期以成人為主的相關數據［15-16］。本研究試著分析新冠疫情發生前后腸桿菌目細菌檢出情況，結果差異無統計學意義，這表明疫情防控可能對我院兒童CRE檢出影響不大，需要長期關注。

66例CRE患兒集中在新生兒科和兒科重癥監護室，<12月齡占比最多，與研究［17-18］一致。一方面這可能與患兒免疫系統不成熟、住院時間久和頻繁進行侵入性操作有關，且患兒相較于成人，需要醫生護士的協助較多，相互間接觸概率增加，進而加大CRE院內傳播的機會。另一方面我院碳青霉素類抗菌藥物主要用于危重癥監護室，以及免疫力低下患者，如燒傷科、血液科等。有研究［19］表明，重癥監護室的病原菌容易呈現多重耐藥的特點，同時重癥監護室環境中更容易出現耐藥菌的定植，增大CRE感染風險。再者，兒童用藥原則與成人不同，其抗感染可用的藥物選擇有限，在當前新生兒或兒科重癥的治療中超說明書用藥現象常見，這也是CRE菌株檢出率高的原因之一。

CRE最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶［20］，利用mCIM聯合eCIM初篩試驗可將其初步分為金屬酶和絲氨酸酶。有研究報道，金屬酶對碳青霉烯類藥物具有較強水解能力，可導致高水平耐藥發生，會給臨床治療帶來極大困難［21-22］。本研究碳青霉烯酶的耐藥基因以NDM型、IMP型、KPC型為主，與報道［16］相一致；45株肺炎克雷伯菌中，以產NDM型和IMP型金屬酶為主，與報道［23-24］相符，這與成人中以產KPC型絲氨酸酶為主不同；另12株大腸埃希菌也以NDM型金屬酶為主。本研究66株CRE菌株對常見抗菌藥物耐藥性均普遍偏高，僅對部分氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥率相對較低。但由于氨基糖苷類和喹諾酮類藥物的不良反應，對兒童革蘭陰性多重耐藥菌感染的治療主要依賴于碳青霉烯類藥物，加之兒童免疫力低下，一旦發生CRE感染，臨床治療較成人更加嚴峻，常陷入無藥可用的境地，亟待新型抗菌藥物的研發［25］。近些年，聯合應用多黏菌素、替加環素與磷霉素等療法；新型β-內酰胺酶抑制劑（齊德巴坦、納庫巴坦等）及新型β-內酰胺酶抑制劑復合制劑（頭孢他啶/阿維巴坦、亞胺培南/瑞巴坦、美羅培南/法硼巴坦等）正被積極開發，給CRE抗感染治療帶來一線曙光［26］。新型β-內酰胺酶抑制劑復合制劑的抗CRE感染作用也與碳青霉烯酶的基因型高度相關，有研究報道頭孢他啶/阿維巴坦對產KPC或OXA-48型絲氨酸酶菌株具有療效，但其對產NDM金屬酶菌株的治療無明顯效果［27］。因此，兒童CRE患者在應用此類藥物前，務必要加強臨床與檢驗的溝通，及時明確碳青霉烯酶基因型，同時積極探索快速檢測碳青霉烯酶基因型的方法［28］。現今關于這些新型抗菌藥物的臨床經驗及評估它們用于兒童人群的臨床報道都很有限，兒童CRE感染治療仍然具有挑戰性。本研究中有部分CRE菌株的碳青霉烯酶基因型未明確，有待深入探討，以便全面了解兒童CRE的耐藥機制與分子流行情況，為患兒臨床治療和感染防控提供更多線索。

綜上所述，兒童CRE感染發生率高，且集中于1~12月齡嬰兒。CRE對抗菌藥物的耐藥性普遍偏高，兒童感染CRE菌株的碳青霉烯酶以金屬酶為主。積極開展CRE主動篩查，加強兒童病區環境衛生學監測，提升醫護人員防控意識，優化抗菌藥物使用，從而遏制兒童CRE感染的暴發與流行。