過敏性紫癜患兒血清降解單糖水平的變化及意義

王志亮 盛楷迪 林毅 張秋業 張麗娟 常紅

（1.青島大學附屬醫院兒童腎臟風濕免疫科，山東青島 266003；2.青島大學附屬婦女兒童醫院，山東青島 266003；3.青島大學附屬醫院系統生物醫學中心，山東青島 266003）

過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP）是一種常見的、由IgA為主的免疫復合物所介導的系統性血管炎［1］。該病在任何年齡均可發病，多見于兒童。其典型臨床特征是非充血性可觸性皮疹（紫癜樣皮疹），伴關節腫痛、腹痛或腎臟受累［2］。研究表明HSP和紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN）患者血清IgA1分子存在糖基化異常，其具體部位位于IgA1分子鉸鏈區的連接O-聚糖，表現為唾液酸基與半乳糖基減少。異常IgA1分子無法及時清除，并誘發自身免疫、產生抗異常IgA1抗體，形成免疫復合物，沉積于靶器官引起炎性反應［3-5］。糖基化是糖鏈基團在糖基化酶的控制下對蛋白的重要修飾，異常糖基化與糖鏈基團的變化密不可分，而血清中降解單糖的含量變化在一定程度上是糖鏈基團數量和聚糖結構變化的反映［6］。青島大學附屬醫院系統生物學張麗娟實驗室利用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC），即PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成［7］，申請了檢測血液中單糖組分（游離單糖或降解單糖 ） 的 專 利 技 術 （CN20140211976.3，CN201710394424.4，CN201810298226），這一技術被稱為“糖指紋”，意為每一種不同疾病都有自己獨特的血清單糖濃度變化。將復雜的糖鏈基團結構降解為單糖組分，簡單快捷地測定血清中單糖含量，完成成分的定性和定量測定，結果準確穩定。張麗娟實驗室利用糖指紋技術發現血清單糖組分在結直腸癌中的變化及意義［8］。目前尚無應用糖指紋技術探索單糖組分在HSP患兒中臨床意義的研究報道。

本研究采用HPLC分析HSP患兒血清降解單糖濃度，探討血清降解單糖與HSP的聯系，尋找潛在的糖類生物標志物，并分析降解單糖對HSP診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2019年9月至2022年1月就診于青島大學附屬醫院兒童腎臟風濕免疫科的132例HSP患兒為研究對象，所有患兒均符合兒童HSP的診斷標準［9］。另選取在我院體檢的健康兒童132例為對照組。2組患兒性別、年齡、體重指數比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。該研究通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會審批（QYFYWZLL26176）。

表1 HSP組與對照組基礎資料比較

1.2 樣本采集

采集HSP患兒及健康體檢兒童空腹（餐后6 h）外周靜脈血4 mL于無菌促凝管，離心后取200μL上清液移于-80°C冰箱統一保存備檢。

1.3 實驗儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent1260）購自美國Agilent公司。標準品：鼠李糖（l-rhamnose monohydrate，Rha）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、氨基半乳糖（galactosamine，GalN）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，Fuc）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、氯仿購于美國SIGMA-ALDRICH公司。乙腈、甲醇為色譜純，氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、乙酸銨、冰醋酸為分析純。

1.4 PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成實驗方法

5μL血清加入5μL（1 mg/mL）Rha、10μL（6 mol/L）鹽酸溶液，運行PCR酸解程序（90 s內升溫至100℃，保持10 min后于120 s內冷卻至4℃），加入20μL（3 mol/L）氫氧化鈉溶液、20μL（0.5 mol/L）PMP后放入PCR儀中運行PCR衍生程序（70℃保持40 min后冷卻至4℃保持10 min），加入20μL乙酸銨緩沖溶液、100μL氯仿萃取后放入離心機（13 300 r/min，15 min），取50μL上清液待HPLC分析。

1.5 HPLC檢測條件

檢測波長254 nm，帶寬4 nm，參比波長350 nm，帶寬100 nm，柱溫37℃，流速1 mL/min，進樣體積20μL。流動相：100%乙腈和乙酸銨緩沖溶液（pH=5.5）。梯度模式：時間梯度：0?10?15?20 min；乙腈的濃度梯度：15%?22%?24%?15%；乙酸銨緩沖溶液（pH=5.5）的濃度梯度85%?78%?76%?85%。

1.6 單糖標準曲線及線性回歸方程式

標準單糖混合溶液等梯度濃度稀釋為10個梯度。將不同濃度梯度的單糖標準品混合液通過HPLC分析得到單糖標準品的HPLC色譜圖（圖1）。將單糖標準品的濃度作為橫坐標，對應的峰面積作為縱坐標，得到對應的單糖標準曲線及相應的方程式（表2）。血清樣品通過HPLC分析得到HPLC色譜圖，因此得到HSP組和對照組兒童血清降解得到的9種單糖濃度（圖2）。因未檢測到血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的濃度在HSP組與對照組差異有統計學意義，所以本研究主要討論HSP患兒血清中Man、GlcN、GalN和Gal與疾病的關系。標準品血清內加入濃度一致的Rha，用于監測血清中有無其他內源性物質干擾單糖的測定。

圖1 10種單糖標準品HPLC色譜圖 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］巖藻糖。a為衍生試劑峰；b為單糖內標試劑峰。

表2 單糖標準品的線性回歸方程式

圖2 血清樣品降解單糖HPLC色譜圖 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］巖藻糖。a為衍生試劑峰；b為單糖內標試劑峰。

1.7 統計學分析

用SPSS 25.0統計學分析軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析Man、GlcN、GalN和Gal對HSP的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組血清4種單糖水平分析

HSP組患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal濃度高于對照組（P<0.001），見表3。

表3 HSP組與對照組單糖水平比較（±s，μmol/L）

表3 HSP組與對照組單糖水平比較（±s，μmol/L）

注：［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖；［HSP］過敏性紫癜。

組別對照組HSP組t值P值例數132 132 Man 2.78±0.35 3.56±0.58 13.27<0.001 GlcN 2.28±0.34 3.02±0.54 13.28<0.001 GalN 1.05±0.19 1.33±0.22 10.94<0.001 Gal 2.11±0.27 2.83±0.51 14.50<0.001

2.2 4種單糖的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，HSP患兒除GalN的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.823外，Man、GlcN和Gal的AUC均>0.9，三者均對HSP有較好的診斷價值（P<0.001），見圖3、表4。

圖3 血清4種單糖ROC曲線 ［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖。

表4 血清單糖水平診斷HSP的ROC曲線分析

3 討論

糖蛋白在機體內承擔著重要功能，如結構、轉運、酶促反應等，特別是在免疫系統。免疫球蛋白都屬于糖蛋白，而糖基化修飾對于蛋白發揮正常功能具有重要意義。糖鏈基團是一類分子結構復雜且龐大的多糖，由多種結構相同或不同的單糖通過糖苷鍵結合而成［10］。糖組學是當前生物學領域的新興學科，主要研究多糖在生物體內的結構和功能。近年來隨著糖組學和糖蛋白組學的發展，糖鏈基團在免疫及免疫系統疾病中的功能機制及作用逐漸成為免疫學的研究熱點［11］。但是與核糖核酸和蛋白質不同的是，糖鏈基團的合成沒有模板，且易受環境的影響；目前對糖鏈基團的多糖結構的解析需要昂貴的儀器和復雜的多糖制備程序，這使得糖鏈基團的基礎研究結果在現階段難以轉化為臨床應用。

單糖是糖基化蛋白中糖鏈基團的最小組成單位，與異常糖基化密切相關，單糖濃度在一定情況下可以反映糖鏈基團異常改變的程度。將復雜的糖鏈基團的多糖結構降解為單糖，分析復雜糖鏈基團的單糖組成可能會是一種新的臨床應用方向。糖鏈基團的多糖結構降解后由以下11種單糖組成，即Man、GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc、GlcN、GalN、Gal、艾杜糖醛酸和唾液酸［7-8］。本研究采用的HPLC分析HSP患兒血清單糖水平，相比較于質譜法，HPLC僅需5μL患兒血清20 min即可完成樣品檢測，一次性可得到9種單糖濃度，且結果可重復性好。

HSP可有皮膚、關節、胃腸道、腎臟等多個器官及系統受累，腎臟損害是影響HSP預后的關鍵因素［12］。有研究表明HSP、HSPN患者血清中半乳糖 缺 陷IgA1（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）水平顯著升高，而Gd-IgA1誘發自身免疫反應產生的抗體可與Gd-IgA1結合并形成免疫復合物，目前公認這是HSP及HSPN發病的關鍵機制［13］。人類血清免疫球蛋白IgA有2個亞型：IgA1和IgA2，其中IgA1鉸鏈區的N-聚糖是由N-乙酰氨基葡糖的β-碳原子與天冬酰胺的酰胺基結合，而IgA1分子不僅有4條N-聚糖，而且還有多達10條的O-聚糖，其基本結構是由N-乙酰氨基半乳糖與鉸鏈區多肽骨架上的蘇氨酸或者絲氨酸的羥基結合形成，而Gal可通過形成β1,3鍵連接至N-乙酰氨基半乳糖上，構成Galβ1,3GalNAc，從而使糖鏈延長。因種種因素，HSP與HSPN患者血清中IgA1糖鏈基團脫中半乳糖豐度顯著下降，而此種Gd-IgA1可使IgA1免疫原性發生改變，從而誘發自身免疫反應，產生抗自身多糖抗體，導致循環免疫復合物的形成，循環免疫復合物可沉積于系膜區，從而引起HSP患兒腎損傷。健康人群血清中IgA1亦含有少量半乳糖缺陷的O-聚糖；而HSPN患者Gd-IgA1比例顯著增高［14］。

因血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的濃度在HSP組與對照組中差異無統計學意義，所以本研究主要討論血清中Man、GlcN、GalN和Gal與HSP的關系。已有的研究顯示HSP患兒Gd-IgA1比例增高［14］，本研究測得HSP患兒血清Gal濃度高于對照組，可能與HSP患兒異常糖基化有關；本研究也顯示HSP患兒的血清Man、GlcN、GalN濃度高于對照組，這提示Man、GlcN、GalN相關的異常糖基化可能參與了HSP的發生發展。ROC曲線分析顯示HSP患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal的曲線下面積分別為0.919、0.913、0.832和0.932，提示患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal可能是診斷及作為監測HSP發生發展的靈敏指標。因PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成的實驗方法降解到的血清單糖為血清中幾乎所有糖蛋白糖鏈的單糖，所以我們暫時不能確定HSP患兒血清中Gal濃度的升高是否完全來源于Gd-IgA1；同樣HSP患兒血清Man、GlcN、GalN的濃度升高原因暫時不明，需進一步的研究證實。且本研究為單中心的研究，只針對HSP患兒和對照組兒童的血清單糖濃度進行檢測，并無其他疾病兒童對照，如IgA腎病兒童，血清Man、GlcN、GalN、Gal是否可作為HSP獨有的血清標志物仍需進一步研究證實。

綜上所述，HSP患兒血清Man、GlcN、GalN、Gal濃度顯著高于健康兒童，可能與HSP患兒血清異常糖基化有關，提示HSP患兒降解單糖的水平對疾病的診斷可能具有重要價值，但是否可以成為臨床診斷及檢測HSP發生發展的獨特標志物尚需進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明無利益沖突。