綿羊骨代謝相關基因VDR密碼子偏好性分析

馬建青，楊清芳，宋占鋒，賈丁丁，吳東蔚，莫秀芳，徐增年，楊 克，吳占勇，籍 穎，周榮艷

(1.華北醫療健康集團邢臺總醫院骨科實驗室，邢臺 054000；2.邢臺市動物疫病預防控制中心，邢臺 054001；3.華北理工大學護理與康復學院，唐山 063210；4.河北醫科大學實驗動物學部，石家莊 050017；5.河北農業大學，保定 071001)

目前已明確維生素D(vitamin D,VD)在機體內主要是由VD受體(VD receptor,VDR)介導而發揮其生理學效應。VD化學本質為環戊烷多氫菲類化合物，在名義上雖屬于脂溶性維生素的家族成員之一，但其本質為類固醇一種激素前體，真正發揮生物學功能的活性形式為1,25(OH)2D3[1]。VDR作為一種重要的核內轉錄因子，在靶細胞內與VD形成激素-受體復合物作用于靶基因的特定DNA序列上發揮生物學效應[2]。最為經典和被廣泛研究的是其參與機體鈣磷平衡的調節機制，如對腸道、骨骼、腎臟及甲狀旁腺等組織的調節作用，維持骨組織礦物質平衡[3]。眾所周知，骨礦鹽代謝失衡可引發骨質疏松癥、骨關節炎、椎間盤退變、骨軟化癥及肌肉減少癥等多種骨代謝相關疾病。目前，VDR在動物醫學及動物遺傳學領域的研究較多，如Santillán等[4]發現小雞骨骼肌細胞中1,25(OH)2D3可以促進鈣離子內流；余曉丹等[5]發現大鼠體內鋅缺乏可直接改變VDR的活性并影響VDR基因mRNA轉錄水平，從而影響鈣結合蛋白基因轉錄，進而影響鈣吸收，最終導致骨生成障礙；趙家榮等[6]成功建立了VDR基因敲除小鼠品系；Plum等[7]通過低鈣喂食方法構建了VD缺乏大鼠模型，利用切除卵巢(OVX)的基本無骨吸收能力大鼠模型研發出一種新型具有強化骨合成代謝活性的1,25(OH)2D3類似藥物，為治療骨質疏松等代謝性骨病提供了新的方法；Miao等[8]綜述了利用純合子轉基因(VDR-/-)小鼠和(1α(OH) ase-/-)小鼠模型研究鈣的腸吸收、骨化三醇的腎磷酸鹽代謝、骨化三醇與骨穩態及骨礦鹽體內代謝等生理機制，較為全面地探討了VD活性代謝物骨化三醇的作用范圍、作用機制和VD/VDR信號途徑的調控機理。

目前，對VD/VDR分子途徑導致骨代謝相關疾病機制研究多集中在嚙齒類、雞等小動物模型上[8-9]，而在密碼子水平對綿羊等實驗大動物VDR基因的研究報道相對較少。綿羊作為一種體型與骨骼較大的哺乳動物，性情溫順，對飼養環境適應性強，有著與人類較為接近的脊柱形態和結構。相對于小動物，用綿羊做骨代謝疾病建模更易于手術操作和觀察[10]。本研究通過對綿羊和其他14個物種VDR基因密碼子偏好性及其影響因素進行分析，以期為預測VDR基因潛在功能、表達水平和基因的異源表達提供重要的理論依據，同時為研究VDR基因進化規律及其在轉錄、翻譯過程中的調控機制提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 VDR基因序列來源

通過檢索GenBank數據庫發現，目前已有880個關于VDR基因CDS區核苷酸序列物種分類單元。本研究選取了脊索動物門中綿羊、大猩猩、鴯鹋和褐家鼠等來自偶蹄目、靈長目、鳥類和嚙齒目的15個物種VDR基因CDS序列(表1)。

表1 VDR基因CDS序列信息

1.2 方法

1.2.1 同義密碼子相對使用度計算 同義密碼子相對使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)通常用來衡量某一種特定密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間使用的相對概率。RSCU臨界值為1，RSCU值>1，有較高使用度；RSCU值=1，未表現出偏好性；RSCU值<1，使用頻率較低。該項參數利用CodonW軟件計算獲得。

1.2.2 密碼子堿基含量、用法分值、用法頻率、有效密碼子數、最佳密碼子使用頻率和密碼子偏好指數計算 GC含量(GC、GC3s)、密碼子第3位上A/T堿基含量(A3s、T3s)和密碼子第1、2位上GC含量及其平均值(GC1、GC2、GC12)的計算均通過CodonW軟件和EMBOSS工具中CUSP(http:∥emboss.bioinformatics.Nl/cgi-bin/emboss/cusp)獲取，其中GC含量和GC3s值是對密碼子在堿基使用上表現出偏倚性的重要反映參數，若它們同時>0.5，則表示該基因傾向于使用G、C的程度高。在多肽鏈翻譯過程中，參與編碼某一氨基酸的各密碼子所占比例之和為1，通常以用法分值(Fraction)表示某一密碼子在編碼時所占比例，用法頻率(Frequency)值表示某一種密碼子在編碼基因所有密碼子數中出現的頻率值，即在1 000個密碼子中出現的次數。ENc值即有效密碼子數(effective number of codons)，能反映出在某個基因中全部用到的密碼子種類，取值范圍為20

1.2.3 ENc-Plot關聯分析 以GC3s值為橫軸、ENc值為縱軸繪制散點圖。如果不同物種的基因參數點位于標準曲線上或附近，則提示基因突變為密碼子偏好性的主要影響因素；若各基因參數點落在曲線下方或更遠處，提示自然選擇壓力對密碼子偏好性作用更為凸顯[15]。

1.2.4 中性繪圖分析 以GC1和GC2的平均值GC12為橫軸、GC3s值為縱軸繪制散點圖。若顯示各基因參數點的斜率趨近于1，說明突變為影響密碼子偏好性使用的主要原因；若斜率向0趨近，則提示自然選擇為其主要影響因素[11,16]。

1.2.5VDR基因的聚類分析 利用DNAMAN 8.0軟件對15個物種VDR基因CDS序列(FASTA格式)進行多重序列比對，刪除各物種間多余不齊的核苷酸種類，序列同一性達90.09%；利用鄰接距離矩陣法進行聚類分析，并構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 綿羊VDR基因CDS區密碼子偏好性分析

由表2可知，所有密碼子中有25個密碼子RSCU值均>1，除參與編碼脯氨酸(Pro)的CCA和終止密碼子TGA外，其他23個密碼子均是以G、C為第3位堿基，且這些密碼子所對應Fraction和Frequency值相對偏高，在編碼對應氨基酸時個數也最多；有2個密碼子RSCU值=1，分別是編碼蛋氨酸/甲硫氨酸(Met)的ATG和編碼色氨酸(Trp)的TGG，提示無使用偏好；對RSCU值<1的密碼子進行分析，37個密碼子大多以A、T結尾，它們的Fraction和Frequency值也偏小。

表2 綿羊VDR基因CDS區密碼子偏好性分析

續表

2.2 綿羊和其他物種VDR基因CDS區各密碼子偏好指標分析

綿羊VDR基因ENc值為38.84(>35)，GC和GC3s值同時>0.5，A3s和T3s的數值明顯小于GC3s值，Fop值>0.5且CBI值>0；綜合分析各物種的ENc值取值范圍在32.72～44.77之間，平均值為39.13，GC、GC3s、GC1、GC2、GC12、A3s、T3s、Fop和CBI值等各項數據在各物種間比較整齊，相互之間相差不大，表現出和綿羊VDR基因密碼子使用的相似特征(表3)。

表3 不同物種VDR基因的密碼子偏好性參數

2.3 不同物種VDR基因RSCU數據分析

所研究的15個物種VDR基因中，RSCU值均>1的密碼子有21個(以密碼子名稱下方標記“XXX”)，這些密碼子(除終止密碼子TGA外)均是以C/G為第3位堿基，分布于除半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸以外的16種氨基酸中，為共同偏好使用的密碼子；同時發現24個密碼子(以密碼子名稱下方標記“XXX”)的RSCU值均<1，它們的第3位堿基基本為A/T，提示它們的使用頻率相對較低。由于蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸僅由1個密碼子編碼，因此不表現出任何偏好性。比較特別的現象是TGC(編碼半胱氨酸(Cys))在褐家鼠中沒有使用偏好性，而在其他物種中均具有較高使用度；GGG(編碼甘氨酸(Gly))是除鴯鹋、褐家鼠、小鼠和原雞外其他物種共同偏好性使用密碼子；CAC(編碼組氨酸(His))是除鴯鹋外其他物種的偏好性使用密碼子；CCG(編碼脯氨酸(Pro))和TCG(編碼絲氨酸(Ser))為鴯鹋和(或)麻雀VDR基因偏好性使用；CCA(編碼脯氨酸(Pro))僅為綿羊和山羊VDR基因偏好性使用(表4)。

表4 不同物種VDR基因的RSCU值

續表

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2.4 ENc-Plot關聯分析結果

基于表3中GC3s和ENc值(GC3s值為橫坐標、ENc值為縱坐標)繪制ENc-Plot關聯分析坐標圖(圖1)，發現散點均落在遠離標準曲線略下方，提示自然選擇壓力可能是導致不同物種VDR基因密碼子偏好性使用的主要影響因素。

圖1 ENC-Plot關聯分析曲線Fig.1 ENc-Plot correlational analytic curve

2.5 中性繪圖分析

GC3的變化和GC12的增長不存在正相關性(斜率為-0.0031，R2=0.0004)，同ENc-Plot關聯分析圖對比顯示，與突變壓力相比，選擇壓力為不同物種VDR基因密碼子使用偏好性的主要力量(圖2)。

圖2 中性繪圖分析曲線Fig.2 Neutrality plot analytic curve

2.6 聚類分析

通過構建系統進化樹(圖3)并基于2.5中RSCU數據分析發現，綿羊和山羊來源于同一支，總變異值較為接近，二者的RSCU值也趨于一致；人和黑猩猩雖起源于同一進化分支，RSCU值基本接近，但是大猩猩對GGG密碼子有著較高偏好性，人與之相反；小鼠和褐家鼠的總變異值僅相差0.003，但是二者對TGC密碼子的使用偏好性也完全相反；大猩猩和黑猩猩雖不在同一分支，但它們的總變異值相同，在RSCU值上也趨于一致；羊駝和野豬的總變異值相同，RSCU值利用性相一致，但是羊駝和牛、山羊、綿羊的進化比野豬更為接近；鴯鹋雖和原雞進化上很接近，但是在編碼組氨酸和絲氨酸時對CAC、TGG的利用表現出獨有的非偏好性特點；麻雀單獨分支，總變異值也最大，對CCG密碼子的使用也與其他物種差異較大。

每條進化分支末尾的數值為物種的總變異值The end of the value is the total variation of the species圖3 各物種VDR基因CDS區的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of VDR gene CDS in different species

3 討 論

蛋白質編碼是一個較為復雜的過程，某一物種或某種基因在編碼時通常對一種或多種特定的密碼子有偏好使用的特點，這種生物學特征即同義密碼子的使用偏好性[17-18]。針對某種功能基因做密碼子偏好性研究對于基因表達具有重要意義，但是密碼子偏好程度會受到基因自身堿基組成結構、染色體中基因位點、基因長度、翻譯起始效應及種屬差異等諸多因素干擾[11,19-25]。

隨著對VDR基因功能研究的深入，其在機體胃腸道保護、發揮抗炎癥效用、維持正常的胰島素分泌和糖耐量等多種疾病中的生理機制逐漸被報道[26-27]。郭勛等[28]通過在飼料中添加不同濃度的VD3發現，VD3/VDR對幼魚生長及病原體識別分子Toll樣受體具有重要的調控作用，而VD/VDR在機體中參與鈣磷代謝、維持骨礦物質穩態是其最經典的生物學作用。本研究發現，綿羊VDR基因的使用偏好密碼子多以G/C為結尾，23個密碼子包括GCC、TGC、GAC、GAG、TTC、GGG、GGC、CAC、ATC、AAG、CTG、CTC、AAC、CCC、CAG、CGG、CGC、AGC、TCC、ACC、GTG、GTC及TAC，這些密碼子的Fraction和Frequency值相對較高，初步判斷它們為偏好性使用密碼子；而參與編碼脯氨酸的CCA和終止密碼子TGA的RSCU值雖>1，但在編碼脯氨酸的4個密碼子中，密碼子CCC對應的RSCU值更大(1.82)，因此在參與編碼時更具優勢。這種特點在分析山羊VDR基因密碼子時同樣存在，而在其他物種中無類似表現，推斷可能與VDR基因表達與偶蹄目羊亞科物種特異性有關。對終止密碼子TGA偏好使用的現象不僅表現在綿羊VDR基因中，在其他物種中其RSCU值(3.00)均>1。針對TGA出現幾率偏高的現象，Sun等[29]曾報道該現象在較為復雜的真核生物中尤其在脊椎動物體內表現更為突出。本研究結果與上述研究結果較一致。進一步對密碼子偏好指標等各項參數計算發現，綿羊VDR基因密碼子使用偏好整體程度偏低，GC含量大于AT含量，對以G/C結尾的密碼子使用偏好程度更強。通過對各物種VDR基因密碼子偏好性參數綜合分析，綿羊及其他物種的使用偏好性整體上具有一致性，同時表現出了對以G/C為第3位堿基的密碼子更為偏好性使用的現象。為進一步明確造成該現象的原因，試驗進行了ENc-Plot關聯分析和中性繪圖分析，結果表明，自然選擇壓力可能是導致綿羊等不同物種VDR基因密碼子偏好性使用的主要影響因素，提示VDR基因多態性的發生可能與之有關[30]，繼而為后期骨代謝疾病模型VDR基因表達水平研究提供了線索。

生物進化是物種最本質的特征之一，在進化過程中，物種對密碼子的使用模式是其進化的重要證據體現。通過對綿羊及其他各物種VDR基因RSCU數據綜合分析結合物種系統進化樹發現，物種間總變異值相同或相近且匯聚于同一進化樹分支時，其密碼子使用偏好性基本一致，但是在個別密碼子使用時仍存在差異；而物種間總變異值雖相近或相同，其RSCU值也相類似，但有可能分屬不同的進化分支；總變異值同其他物種差距較大的麻雀在系統進化樹上獨自分支，它在密碼子偏好性使用上也顯現出獨有的特點。由此提示，物種間種屬差異會對密碼子偏好性使用產生一定程度的影響，同時由于基因結構、長度及堿基組成等因素，對密碼子偏好性使用的作用也需加以關注，在動物骨代謝疾病遺傳學領域未來發展中應重要關注此方面研究，從而為生物進化、生物多樣性及揭示相關疾病在不同動物中的發病特點提供新的研究方向。

VD/VDR信號通路在調控機體鈣磷代謝和骨礦鹽平衡中發揮著極為重要的生理作用，多種疾病的發生與之密切相關。目前對綿羊等體型較大實驗動物VDR基因密碼子偏好性分析鮮見報道。本研究通過分析綿羊VDR基因CDS區密碼子偏好性使用并與其他多個物種相比較，結果為人們利用綿羊這種大動物模型研究骨質疏松、軟骨病等骨代謝相關疾病提供參考，具有一定的理論和現實意義。

4 結 論

通過對綿羊及來自偶蹄目、靈長目、鳥類和嚙齒目的15個物種VDR基因密碼子偏好性使用進行比較分析，以G/C結尾的密碼子為VDR基因優勢密碼子，導致密碼子偏好性使用的主要因素為自然選擇作用，多物種RSCU數據分析和系統進化樹顯示出密碼子偏好性使用存在物種特異性，并與物種親緣關系進化具有關聯性。