布魯氏菌分泌蛋白BspI生物信息學分析及多克隆抗體制備

肖洋洋，馬忠臣，李芮芮，陳創夫，鄭 煒，王 勇，王鵬雁

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2.綿羊健康養殖與人獸共患病防控協同創新中心，石河子 832003；3.動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003)

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的人畜共患傳染性疾病[1]。感染該病后，母畜主要表現為妊娠期流產，早中期最為多見，產死胎、木乃伊胎，還伴有母畜的壞死性胎盤炎、子宮內膜炎等；公畜主要表現為關節腫脹、疼痛，睪丸炎，不育；人則主要發生周期性發熱、乏力、多汗、關節炎，孕婦則可發生流產[2]。據調查，近年來該病在中國的發病率逐年上升[3-4]。由于還沒有研制出防治布魯氏菌病的理想疫苗，該病仍對全球的養殖業發展帶來挑戰[5]。

布魯氏菌是典型的胞內寄生菌，感染宿主之后，被吞噬細胞吞噬或侵入非吞噬細胞，會隱藏在膜結合室(該膜結合室被稱為布氏小體，BCV)中[6-7]。在初期，BCV利用胞吞途徑及分泌途徑來維持布魯氏菌的胞內存活；在中期的成熟階段，BCV將抑制布魯氏菌與溶酶體的結合，逃避宿主的免疫殺傷作用；在后期，BCV與分泌途徑相互作用從而與內質網融合，其還會與內吞途徑相互作用觸發自噬，滿足布魯氏菌長期在細胞內生長與增殖的條件[8-9]。研究證實，布魯氏菌在內質網中的增殖過程中可以使細胞內質網結構重組，誘導內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，激活未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)，從而促進布魯氏菌的胞內寄生[10-11]。免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin-binding protein，Bip/GRP78)是內質網應激的標志分子，ERS發生時，Bip的表達量增加，可以激活UPR[12]。

BspI是一個新的效應蛋白，由布魯氏菌1號染色體BAB1-1865基因編碼，有GTPase活化域(98-220位氨基酸)、信號肽域(1-17位氨基酸)和轉膜域(17-33位氨基酸)3個特殊的結構域[13]。GTPase活化域理論上能夠調節內質網小G蛋白的活性，影響內質網的組裝[14]。研究表明，BspI蛋白可以上調小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)Bip的表達，并可以誘導白介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌增多，剪切型X盒結合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP-1S)表達量增加，表明BspI蛋白可以作用于RAW264.7細胞，誘導RAW264.7中的ERS，并激活ERS中的UPR[15],在布魯氏菌的胞內寄生中發揮了重要的作用。BspI作為分泌蛋白，其分泌途徑尚不清楚，因此，本研究通過原核表達系統表達出布魯氏菌分泌蛋白BspI，免疫試驗兔后制備兔抗BspI多克隆抗體，以期為后續進行該蛋白的亞細胞定位及潛在功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和試驗動物 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞，滅活羊種16M布魯氏菌菌株均由新疆疾病預防控制中心提供；pMD19-T克隆載體、pET-28a表達載體均購自TaKaRa公司；2只2月齡雄性新西蘭大白兔(約1.5 kg)購自新疆醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 細菌質粒小提中量試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、DAB顯色液均自天根生化科技(北京)有限公司；誘導劑IPTG購自Merck公司；T4 DNA連接酶、2×EsTaqMasterMix、DNA快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、限制性內切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ均購自TaKaRa公司；綿羊抗兔IgG、脫脂奶粉、PVDF膜均購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 BspI蛋白的生物信息學分析 利用TMHMM Server v.2.0在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測BspI蛋白的跨膜區；利用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale/)預測BspI蛋白的親/疏水性；利用件SignalP 5.0 Server在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測BspI蛋白的信號肽；利用NetPhos 3.1 Server在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測BspI蛋白的磷酸化位點；利用Predicting Anti-genic Peptides在線軟件(http:∥imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預測BspI蛋白的抗原決定簇；利用SOPMA在線軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)預測BspI蛋白的二級結構；利用SWISS-MODEL在線軟件(http:∥swiss-model.expasy.org/)對BspI蛋白的三級結構自動建立空間模型。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 根據布魯氏菌菌株16MBspI基因序列(GenBank登錄號：DK63_1233，675 bp)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物BspI-F/R，BspI-F：5′-GGATCCATGCTTGGCG-

TTCTCGTGGC-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點)；BspI-R：5′-CTCGAGCTATTGCATGTCGCGG-

ATGC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以滅活羊種布魯氏菌菌株16M菌液為模板，進行目的基因BspI的PCR擴增。PCR反應體系25 μL：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 9.7 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并對鑒定正確的產物進行切膠回收。

1.2.3 pMD19-T-BspI克隆載體的構建與鑒定 回收純化的BspI基因與pMDl9-T克隆載體連接，16 ℃水浴過夜,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂含氨芐抗性的固體LB培養基過夜培養，挑菌活化進行菌液PCR鑒定并送昆泰銳生物技術有限公司(武漢)測序，連接成功后的產物命名為pMD19-T-BspI。

1.2.4 pET-28a-BspI重組表達載體的構建 將pMD19-T-BspI和pET-28a載體搖菌提取質粒，同時用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，回收pET-28a載體及目的片段。pET-28a載體與目的片段用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂含卡那抗性的固體LB培養基過夜培養，挑菌活化進行菌液PCR并送昆泰銳生物技術有限公司(武漢)測序，連接成功后的產物命名為pET-28a-BspI。

1.2.5 BspI的誘導表達及純化 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，活化后接種于含卡那抗性的LB液體培養基中，搖菌至D600 nm值為0.7。加入誘導劑1 mmol/L IPTG，分別于0、2、4、6及8 h取出對應的菌液，12 000 r/min離心1 min，加入80 μL蒸餾水和20 μL蛋白上樣液混勻，100 ℃沸水浴10 min，進行12% SDS-PAGE分析。

將菌液擴大培養600～800 mL，搖菌至D600 nm值為0.7，加入誘導劑1 mmol/L IPTG，誘導至最佳時間收菌，置于液氮中反復凍融3次，超聲破碎離心，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。利用His標簽蛋白純化柱進行表達蛋白的純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析，并使用BCA試劑盒測定濃度，-80 ℃保存備用。

1.2.6 BspI多克隆抗體的制備 將純化后的蛋白混合弗氏佐劑免疫試驗兔，免疫前耳動脈采血1～2 mL做陰性對照，首免按每800 μg/只混合等體積弗氏完全佐劑，乳化后皮下5點注射；間隔3周，耳動脈采血1～2 mL后進行二免，800 μg蛋白混合等體積弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點注射；間隔3周，耳動脈采血1～2 mL用作Western blotting及ELISA檢測，同時三免，500 μg蛋白混合等體積弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點注射；間隔2周四免，500 μg蛋白混合弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點注射；間隔1周，耳中動脈采血1～2 mL用于Western blotting及ELISA檢測，3 d后頸動脈采血50 mL。

1.2.7 多克隆抗體的鑒定 取純化后的BspI蛋白進行SDS-PAGE分析，切下目的膠塊將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，以制備的兔抗BspI蛋白多克隆抗體(稀釋比1∶100)為一抗，37 ℃孵育2 h；山羊抗兔IgG-HRP(稀釋比1∶3 500)為二抗，37 ℃孵育2 h，用DAB顯色液顯色，拍照留存。

1.2.8 多克隆抗體效價的間接ELISA檢測 取純化后的BspI蛋白稀釋為1.5、2、2.5 μg/mL包被酶標板，4 ℃過夜；以制備的多克隆抗體為一抗，稀釋為1∶200、1∶250、1∶300和1∶350，37 ℃避光孵育1 h；以山羊抗兔IgG-HRP為二抗，稀釋度為1∶10 000、1∶20 000、1∶30 000和1∶40 000，37 ℃避光孵育30 min，同時設置陰性對照，TMB顯色15 min，用酶標儀測定D450 nm值。

2 結 果

2.1 BspI蛋白的生物信息學分析

2.1.1 跨膜區、親/疏水性和信號肽預測 BspI蛋白分子式為C1151H1835N339O292S6，編碼220個氨基酸，根據TMHMM Server v.2.0在線軟件分析，BspI蛋白有1個跨膜結構(圖1)。利用ProtScale在線軟件預測發現，BspI蛋白親水性平均系數為0.789，為親水性蛋白(圖2)。利用SignalP 5.0 Server在線軟件預測顯示，BspI蛋白無信號肽(圖3)。

圖1 BspI蛋白跨膜結構預測Fig.1 Transmembrane structure prediction of BspI protein

圖2 BspI蛋白親/疏水性預測Fig.2 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BspI protein

圖3 BspI蛋白信號肽預測Fig.3 Signal peptide prediction of BspI protein

2.1.2 磷酸化位點預測 運用NetPhos 3.1 Server在線軟件預測BspI蛋白的磷酸化位點，高于閾值0.5的為潛在磷酸化位點，經分析發現，該蛋白在第1、42、49、76、111、127、208位絲氨酸處，第52、78、91、112、206位蘇氨酸處，以及第68位酪氨酸處發生了磷酸化(圖4)。

圖4 BspI蛋白磷酸化位點預測Fig.4 Phosphorylation site prediction of BspI protein

2.1.3 抗原決定簇預測 通過在線軟件Predicting Anti-genic Peptides進行預測，該蛋白有7個抗原決定簇，分別在7-49、79-89、98-111、113-142、165-171、175-183、205-216位氨基酸處(表1)。

表1 BspI蛋白抗原決定簇預測

2.1.4 二級結構和三級結構預測 根據SOPMA在線軟件分析，BspI蛋白二級結構中α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲占比分別為30.45%、29.55%、10.45%和29.55%(圖5)。根據SWISS-MODEL在線軟件對BspI蛋白的三級結構自動建立空間模型，顯示以α-螺旋為主(圖6)，與二級結構預測結果一致。

線條從長到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲The order of lines from long to short are alpha helix,extended chain,beta turn and random coil圖5 BspI蛋白二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of BspI protein

圖6 BspI蛋白三級結構預測Fig.6 Tertiary structure prediction of BspI protein

2.2 BspI蛋白多克隆抗體制備

2.2.1BspI基因PCR擴增 以布魯氏桿菌菌株16M為模板，以特異性引物BspI-F/R進行PCR擴增，結果顯示BspI基因片段大小為675 bp(圖7)，與預期相符。

M,DL2000 DNA Marker；1，陰性對照；2～4，BspI基因PCR擴增產物M,DL2000 DNA Marker;1，Negative control；2-4，PCR amplification products of BspI gene圖7 BspI基因PCR擴增結果Fig.7 PCR amplification results of BspI gene

2.2.2 重組克隆質粒pMD19-T-BspI的菌液PCR鑒定 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴增產物后，將其連接到pMD19-T克隆載體上，經菌液PCR鑒定發現，條帶大小為675 bp(圖8)，與預期相符。測序比對表明重組質粒pMD19-T-BspI構建成功。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對照;2～6,pMD19-T-BspI的菌液PCR產物M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2-6,PCR products of bacterial solution of pMD19-T-BspI圖8 pMD19-T-BspI菌液PCR驗證Fig.8 PCR results of pMD19-T-BspI bacterial solution

2.2.3 重組表達質粒pET-28a-BspI的菌液PCR鑒定 重組質粒pMD19-T-BspI和載體pET-28a分別被BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，經菌液PCR鑒定發現，條帶大小為675 bp(圖9)，與預期相符。表明BspI基因已成功插入pET-28a表達載體中。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對照;2、3,pET-28a-BspI的PCR產物M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2 and 3,PCR products of pET-28a-BspI圖9 pET-28a-BspI菌液PCR驗證Fig.9 PCR results of pET-28a-BspI bacterial solution

2.2.4 BspI蛋白的誘導表達及純化 分別取未誘導及誘導2、4、6、8 h的菌液及菌液超聲后的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果顯示，BspI蛋白(25.3 ku)會形成包涵體，在上清中不表達，37 ℃誘導8 h左右蛋白的表達量最高(圖10)；經His標簽鎳柱純化后進行SDS-PAGE分析，結果顯示，在約25.3 ku處出現單一的條帶(圖11)，表明BspI蛋白純化成功，且濃度為1.5 mg/mL。

M，蛋白質分子質量標準;1，空菌對照；2～5，表達菌誘導2、4、6、8 h；6，超聲后的上清液；7，超聲后的沉淀M，Protein Marker;1,Control of empty bacteria;2-5,The expression bacteria were induced for 2,4,6 and 8 h，respectively;6,Supernatant after ultrasound;7,Precipitate after ultrasound圖10 BspI蛋白誘導表達后的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of induced expression of BspI protein

2.2.5 BspI多克隆抗體的Western blotting鑒定 將純化后的BspI蛋白轉到0.45 μm的PVDF膜，以免疫后的兔血清為一抗、山羊抗兔IgG-HRP為二抗孵育，用DAB顯色液顯色，在25.3 ku左右出現了一條特異性、較粗的條帶(圖12)，表明兔血清里面含有抗BspI蛋白的抗體，可以與純化后的蛋白發生特異性結合，因蛋白濃度較高，所以條帶較粗。Western blotting結果表明，BspI免疫兔后，兔體內產生了針對BspI蛋白的抗體，因此利用采集的血清作為一抗時，血清內抗體可以與BspI蛋白進行特異性結合，表明多克隆抗體制備成功。

M，蛋白質分子質量標準;1、2,經His標簽鎳柱純化、濃縮后的蛋白M，Protein Marker;1 and 2,The protein was purified and concentrated over the His tagged nickel column圖11 BspI蛋白純化結果Fig.11 Purification results of BspI protein

1、2,BspI蛋白的DAB顯色；M,蛋白質分子質量標準1 and 2,DAB color rendering of BspI protein；M，Protein Marker圖12 BspI多克隆抗體的Western blotting鑒定Fig.12 Western blotting identification of BspI polyclonal antibody

2.2.6 BspI多克隆抗體的間接ELISA抗體效價分析 首先通過方陣滴定法確定蛋白的最佳包被濃度，三免后收集血清，以免疫前的兔血清作陰性對照，得到蛋白的最佳包被濃度為1.5 μg/mL，在BspI蛋白的最佳包被濃度為1.5 μg/mL、一抗稀釋度為1∶350、二抗稀釋度為1∶40 000時，P/N值最大為8.696(表2)。通過倍比稀釋對BspI蛋白的抗體效價進行分析發現，在一抗稀釋度為1∶12 800時，血清中的抗體與BspI蛋白的結合度達到最高；在一抗稀釋度為1∶409 600時，P/N值開始<2，表明制備的抗體可以很好地與BspI蛋白結合，抗體效價為1∶409 600(圖13)。

表2 方陣滴定結果(P/N)

圖13 兔抗BspI蛋白多克隆抗體效價測定Fig.13 Titer determination of rabbit polyclonal antibody against BspI protein

3 討 論

布魯氏菌是胞內寄生菌，侵入機體后分布于各個組織器官，胎衣、胎兒、胎盤以及乳腺、網狀內皮系統、淋巴結最有利于其增殖[16]。研究發現，布魯氏菌的胞內寄生機制與Ⅳ型分泌系統(T4SS)有密切的聯系[17]。T4SS的表達是布魯氏菌在宿主細胞內發揮毒力的一個重要標志[18-19]。布魯氏菌的效應蛋白分泌有兩種：依賴T4SS和非依賴T4SS[20]。目前，對依賴T4SS的蛋白研究已經很成熟，依賴型效應蛋白在布魯氏菌感染宿主及誘發ERS反應中發揮著調節作用，而非依賴型效應蛋白的研究較少[21]。BspI蛋白是非依賴T4SS的分泌蛋白，能參與布魯氏菌胞內感染引起宿主細胞的ERS[22]。本實驗室前期對布魯氏菌分泌蛋白BspG和BspJ的研究發現，這2個蛋白都可以進入宿主細胞的細胞核，能夠在細胞核到細胞質間穿梭，而BspI具有和這2個蛋白相似的分泌方式，因此推測BspI也可能會進入宿主細胞的細胞核，影響宿主細胞的轉錄和基因的表達，進而影響宿主細胞的生存與繁殖，使布魯氏菌能在胞內長期生存。然而該推測還需要對BspI進行更進一步的分析及驗證。

本研究利用在線軟件分別對BspI蛋白的跨膜結構、親/疏水性、信號肽、磷酸化位點、抗原決定簇進行了分析，結果顯示，BspI蛋白編碼220個氨基酸，有1個跨膜結構域，不含信號肽，有13個磷酸化位點和7個抗原決定簇，是一個不穩定的親水性蛋白。該蛋白被預測為跨膜的親水蛋白，但不含信號肽，表明該蛋白可能定位于細胞膜上，而Myeni等[23]通過CyaA報告子融合試驗發現，當在C-端融合報告子時，BspI的分泌是依賴VirB T4SS的；當標記在N-端時，BspI的分泌不依賴于VirB T4SS。在布魯氏菌的效應蛋白中，BspD、BspH、BspJ都與BspI分泌方式相似[24]。表明布魯氏菌中可能存在另一種未發現的分泌系統，而BspI蛋白可能是通過T4SS和這種分泌系統混合分泌到宿主細胞。同時，有研究顯示，費氏弧菌可以通過鞭毛調控外膜蛋白的分泌來影響細菌對宿主細胞的毒力[25]，而布魯氏菌和費氏弧菌都是單極鞘鞭毛[26]，推測布魯氏菌的鞭毛能夠和T4SS共同調控一些效應蛋白的分泌，但仍有待進一步研究。對BspI蛋白的二級結構預測發現，該蛋白主要由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，α-螺旋占比最大(30.45%)。生物信息學分析還發現，BspI蛋白具有7個抗原決定簇，表明該蛋白作為抗原可以引起宿主良好的免疫反應。

本研究還通過大腸桿菌原核表達系統對BspI蛋白進行表達，免疫試驗兔制備了多克隆抗體。在表達及純化試驗中發現BspI蛋白在上清中基本沒有表達，在沉淀中形成包涵體，包涵體蛋白的純化過程非常繁瑣，且在復性過程中BspI蛋白極易變性析出，這與生物信息學分析時得出的該蛋白不穩定性較高的結果一致。因此在試驗過程中嘗試在蛋白中加入10%甘油，增加溶液的黏性，減少蛋白質之間的相互碰撞而沉淀，發現可以明顯減少蛋白的析出變性。使用純化后的蛋白免疫兔后，在2周左右即可通過Western blotting檢測到抗體；三免后用間接ELISA法測定制備的多克隆抗體效價，結果顯示抗體效價在1∶409 600左右，表明該蛋白具有較好的免疫原性及反應原性，為今后亞單位疫苗的研發提供試驗數據。通過BspI蛋白的生物信息學和多克隆抗體的效價分析表明，BspI蛋白可能對布魯氏菌在宿主細胞內的生存與繁殖有一定的影響，從而有利于布魯氏菌在細胞內的長期生存，也可為進一步研究BspI蛋白的亞細胞定位和布魯氏菌鞭毛對分泌蛋白的調控提供材料，為研究BspI蛋白的結構和功能提供參考。

4 結 論

BspI蛋白為親水性蛋白，有跨膜區，無信號肽，有13個磷酸化位點和7個抗原決定簇，二級結構以α-螺旋、延伸鏈和無規則卷曲為主要組成部分；成功構建了布魯氏菌分泌蛋白BspI的原核表達載體，表達純化出25.3 ku的蛋白，并免疫試驗兔獲得了多克隆抗體，抗體效價為1∶409 600，具有較好的反應原性和免疫原性。