基于CRISPR-Cas系統的病原體檢測研究進展

張慶勛，鐘震宇，郭青云，何宏軒，白加德

(1.北京麋鹿生態實驗中心，北京 100076；2.北京生物多樣性保護研究中心，北京 100076；3.中國科學院動物研究所，北京 100101)

近年來，新發突發人獸共患病、動物疫病如新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、寨卡病毒、埃博拉病毒、甲型流感病毒、非洲豬瘟病毒等，嚴重威脅公共衛生及獸醫衛生安全[1-2]?？焖?、靈敏、特異的檢測方法對于傳染病的防控至關重要[3-4]。目前動物病原體常見的檢測方法包括基于抗原抗體的免疫學方法、聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光定量PCR方法、基因組測序方法等[5-8]，但是這些方法存在一定的局限性，如非特異性的干擾、耗時、價格高、對設備的依賴性強等。病原體檢測的最為理想的方法應當是快速、靈敏、特異、經濟實惠、設備自由且直觀的方法。

CRISPR-Cas系統源自細菌的適應性免疫系統，因其識別和剪切特定DNA或RNA序列的能力而在基因編輯領域得到廣泛研究。除基因編輯功能外，Cas核酸酶(如Cas12和Cas13)在特異識別和結合靶標核酸后，表現出強烈的附屬切割活性，即非特異地切割周圍的RNA或DNA[9]。目前，基于CRISPR-Cas13a的特異高靈敏度酶報告系統(SHERLOCK)[10]以及基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2快速檢測方法(DETECTR)[11]已被開發出來，并且相關的SARS-CoV-2檢測試劑盒已獲得美國食品藥品監督管理局(FDA)的緊急使用授權?；贑RISPR-Cas系統的診斷方法作為新一代的診斷技術，表現出靈敏度高、特異性好等諸多優點，并且可以實現快速即時檢測，在病原體檢測方面具有巨大應用前景。作者將對CRISPR-Cas系統類型及其在病原體快速檢測中的最新進展展開論述。

1 CRISPR-Cas系統類型及應用

CRISPR-Cas系統是細菌的一種RNA引導的適應性免疫系統，通過RNA引導Cas核酸酶與特定的核酸序列結合并切斷該序列，用以抵抗外源DNA或病毒的入侵[12]。CRISPR-Cas系統可分為兩大類、6種型、33種亞型。類別1包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型及16個亞型，主要由多個Cas核酸酶組成的復合物發揮作用。與類別1不同，類別2包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型及17個亞型，僅需要1個大的多功能結合域的Cas核酸酶。其中Cas9存在于所有Ⅱ型系統，Ⅴ型和Ⅵ型CRISPR-Cas系統均包含多種變體，Ⅴ型主要由DNA酶Cas12a、Cas12b和Cas14組成，Ⅵ型包括Cas13a和Cas13b，其只能切割靶標RNA序列[13-15]。

在CRISPR-Cas9系統中，CRISPR RNA(crRNA)會與反式激活crRNA(tracrRNA)結合形成指導RNA(gRNA)，目前的研究已將二者整合為單一向導RNA(sgRNA)。Cas9蛋白在sgRNA的協助下精準定位到原間隔序列臨近基序(PAM)靶位點，最終完成對雙鏈DNA的精準切割(圖1)。目前，CRISPR-Cas9系統已成為強有力的基因編輯工具，廣泛應用于各個領域[16]。在Ⅴ型CRISPR-Cas系統中，tracrRNA能夠干擾Cas12b和Cas12c，但不影響Cas12a。Cas12a在crRNA介導下靶向切割富含T堿基的PAM區的雙鏈DNA(dsDNA)，同時激活Cas12a的單鏈DNase活性，進而以非特異性的方式切割非靶標單鏈DNA(ssDNA)[17]?；贑as12a的這種特性，CRISPR-Cas12系統被廣泛應用于DNA的檢測。與Cas12不同的是，Cas13和Cas14核酸酶crRNA介導下分別靶向切割目標單鏈RNA(ssRNA)和ssDNA，核酸酶被激活后通常表現出附屬切割活性，切割非特異性ssRNA和ssDNA(圖1)[18-19]。此外，Cas13和crRNA復合體切割ssRNA時，不需要tracrRNA和PAM區，但是其與ssRNA的結合需要原型間隔序列(即PFS區)[15]。

隨著新的CRISPR-Cas12/Cas13系統的發現及其作用機理的逐步揭示，這些系統實現了更加精準高效的基因編輯。鑒于CRISPR-Cas12/Cas13在DNA及RNA檢測中的優勢，這兩種系統被廣泛應用于病原體快速診斷技術的研究。其中最為經典的是基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK以及基于CRISPR-Cas12a的DETECTR，這兩種檢測方法都是利用熒光信號強度來表征檢測結果[10-11]。簡單來說，首先構建FAM及BHQ熒光基團標記的非靶標ssRNA或dsDNA報告基因；在系統識別了目標基因以后，Cas13和Cas12的附屬切割活性被激活，進而切割非靶標ssRNA或dsDNA報告基因，最終通過多功能酶標儀讀取樣本熒光強度。相較于傳統的檢測方法，CRISPR-Cas系統表現出快速、靈敏度高、特異性好、適用范圍廣等諸多優點，在腫瘤、單核苷酸多態性(SNP)及遺傳病、病原體(病毒、細菌、寄生蟲)、耐藥基因、有機小分子、金屬離子、水質、公共衛生等檢測方面得到了廣泛的應用(圖1)[20-22]。

圖1 CRISPR-Cas系統在快速檢測中的應用Fig.1 Applications of CRISPR-Cas system in rapid detection

2 CRISPR-Cas病原體快速檢測技術

2.1 CRISPR-Cas系統在病毒檢測中的研究

CRISPR-Cas系統在新發突發傳染病、人獸共患病、動物疫病檢測中得到廣泛的應用。Pardee等[23]開發了一種基于RNA等溫擴增及傳感器相結合的CRISPR裂解方法，并且成功從血液樣本中檢測具有單核苷酸多態性差異的美國和非洲寨卡病毒(ZIKA)毒株。Zhang等[24]構建了基于CRISPR-Cas9的HPV16/18的檢測及分型方法，該方法首先通過PCR方法進行擴增，而后基于CRISPR-Cas9切割的熒光信號鑒定PCR產物。此外，科研人員通過改造CRISPR-Cas9系統開發了一種新型蛋白質研究技術(PICASSO)，該方法將經修飾、無催化活性的Cas9蛋白(Cas9識別DNA序列但不進行切割)與定制的肽復合物相連，利用sgRNA引導該復合物與DNA自組裝，用此方法構建的DNA-蛋白質微陣列能夠快速識別樣本中的上千種抗體。基于這種特性，PICASSO成功檢測了新型冠狀病毒肺炎康復者的血液中是否存在與病原體蛋白質結合的抗體[25]。

Cas13a是目前發現的唯一一個靶向ssRNA的核酸酶，并且Cas13a附屬切割活性也僅針對ssRNA。Gootenberg等[26]開發出基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK系統后，首先將其運用于ZIKA和登革熱病毒(DENV)的檢測中，該方法的檢測靈敏度達到阿摩爾(aM)級別。為了進一步擴展該方法的應用，研究人員對該方法進行了優化，建立了SHERLOCKv2系統。此方法利用CRISPR Ⅲ類效應器核酸酶Csm6來提高不同細菌種類Cas13酶的附帶切割活性，增加其檢測靈敏性；同時依托FAM-生物素系統建立了側向層析試紙條，適用于現場的核酸可視化快速檢測方法[27]。為了使檢測過程更加便捷，研究者將SHERLOCK與一種對未提取的診斷樣品進行加熱來消除核酸酶的方法(HUDSON)聯用，免去了核酸提取的步驟，實現了對DENV、埃博拉病毒、拉沙病毒的快速檢測[28-29]。之后，研究人員在原有的技術基礎上建立了STOPCovid.V2法，通過磁珠優化RNA的提取，不僅縮短RNA提取時間，同時提高了方法的檢測靈敏度，在臨床樣本的檢測中，該方法能夠達到93.1%的靈敏度和98.5%的特異性，并且陽性樣本只需15～45 min即可獲得檢測結果[10]，目前該方法已經通過FDA批準授權使用。此外，多項研究將CRISPR-Cas13a用于SARS-CoV-2、Epstein-Barr病毒(EBV)、乙肝病毒(HBV)、BK多瘤病毒/巨細胞病毒(BKV/HCMV)、禽流感病毒(AIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)、犬細小病毒(CPV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)等病毒的快速檢測技術研發[30-37](表1)。

CRISPR-Cas12是一種強大的基因編輯系統，研究發現毛螺旋菌科細菌(Lb)的Cas12a能夠在crRNA的介導下靶向切割dsDNA或ssDNA，并且觸發附屬非特異性切割ssDNA熒光報告基因的能力。Chen等[38]利用LbCas12a與RPA聯用建立了適用于DNA檢測的DETECTR系統，該系統被首先運用于人乳頭瘤病毒(HPV)的檢測，能夠有效檢測出臨床的高危亞型HPV16/18。在基于Cas12a建立JEV檢測方法HOLMERS的基礎上[39]，Li等[40]利用Cas12b與LAMP反應聯用構建了HOLMERSv2方法，該方法利用依賴RNA的DNA聚合酶，去除了逆轉錄的過程，使JEV的檢測更加便利。進一步研究發現，Cas12a/b能夠同時檢測DNA和RNA靶標，基于Cas12a/b系統與多種核酸擴增方法(如RT-RPA/RT-LAMP等)聯用開發出了SARS-CoV-2、ASFV、PB-19/CPV等病毒的檢測方法[41-46]。

2.2 CRISPR-Cas系統在細菌檢測中的研究

目前，在細菌快速檢測方法研究中最常用的是CRISPR-Cas9/12/13系統。Wang等[47]將CRISPR-Cas9與側向層析法相結合，構建了稱為CASLFA的檢測方法，該方法能夠在非實驗室條件下以100%的準確性檢測單核李斯特菌、轉基因生物、ASFV等。此外，研究人員開發了一種基于Cas9切口酶擴增的方法(Cas9nAR)，與側向層析試紙條相結合，可以作為鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的雙重檢測系統[48]。Li等[49]利用CRISPR-Cas12a與電化學信號相結合，開展了食品中單核李斯特菌的快速及現場檢測?；贑RISPR-Cas12a、RPA、熒光信號檢測等方法，Wang等[50]建立了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7的快速檢測方法-OCTOPUS，該方法能夠在50 min內實現阿摩爾(aM)級的核酸檢測。除了CRISPR-Cas12a-RPA以外，CRISPR-Cas12b-LAMP也適用于結核分支桿菌檢測方法的開發[51-52]。越來越多的研究證明，CRISPR-Cas12/13系統能夠被廣泛應用于細菌快速、靈敏的現場檢測，如副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、海洋創傷弧菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等(表1)[53-58]。

2.3 CRISPR-Cas系統在寄生蟲檢測中的研究

隨著CRISPR-Cas系統在病毒、細菌等病原體檢測中的廣泛應用，研究人員開始探究此方法用于寄生蟲病的檢測。Lee等[59]首先通過SHERLOCK檢測平臺建立了惡性瘧原蟲(即鐮刀瘧原蟲)的診斷方法，同時該方法能夠鑒別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲。同時這種方法優化了核酸提取過程，能夠在60 min內檢測出每毫升血液中的2個瘧原蟲，符合了WHO建議的檢測靈敏度?；贑RISPR-Cas12系統，Yu等[60]建立了另外一種原蟲(微小隱孢子蟲Ⅱd亞型)的快速檢測方法，該方法與其他亞型的微小隱孢子蟲無交叉反應，表明其特異性較好。此外，CRISPR-Cas12系統也被用于弓形蟲的檢測方法開發，該方法的靈敏性能夠達到飛摩爾(fM)級別(表1)[61]。

2.4 基于CRISPR-Cas系統的病原體高通量及多重檢測

CRISPR-Cas系統與微流控技術的結合，可以使多個樣本或多個病原體的同時檢測成為可能。Qin等[62]建立了一種基于CRISPR-Cas13a與自動化微流控POC技術聯用的病原體核酸檢測方法，該方法可以在無需核酸擴增的條件下，實現數十個樣本中埃博拉病毒的高通量檢測。此外，Ackerman等[63]開發了一種基于核酸多重評估的組合排列反應(CARMEN)，將CARMEN與Cas13a、微孔陣列結合形成一種多通道檢測方法。CARMEN-Cas13方法能夠對169種人類病毒同時運行4 500次的測試，同時該平臺還能夠區分多種亞型的流感病毒和完成數十種耐藥HIV病毒毒株的鑒定。

3 CRISPR-Cas病原體檢測技術研究中的關鍵問題

3.1 靶標基因的序列保守性

對于Cas12，在crRNA設計時，需要考慮的問題主要是PAM區以及與crRNA互補的靶標基因的保守性，這是開發CRISPR-Cas12檢測方法成功與否的關鍵[55]。研究顯示，crRNA靶向區的堿基錯配顯著影響Cas核酸酶的切割效率[64]。這種特性也表明了Cas12方法的高特異性，但是同時也存在一定的問題，如較短的靶標序列或者存在堿基錯配時，高度保守序列的篩選難度增加，可能影響其檢測效率。在空腸彎曲桿菌CRISPR-Cas12b快速檢測方法開發時，研究人員分析了1 037條空腸彎曲桿菌的全基因組序列，鑒定出了1條20 bp長度的序列在1 024條空腸彎曲桿菌的全基因組中高度保守，并且是空腸彎曲桿菌所特有的[56]。同時，為了擺脫該方法對于PAM區的依賴，研究人員設計了2種方案：一是通過PCR外源引入PAM區改進HOLMES法[39]；二是設計2條不具有PAM區特性的crRNA，增加反應的檢測靈敏性[65]。對于Cas13a，其crRNA設計需要涉及PFS區，然而Cas13a的這種局限很容易消除，比如選擇PFS區非依賴性的LwaCas13a[26]。然而，對于易突變的RNA病毒，一旦產生突變將會影響CRISPR-Cas的檢測效率。Liu等[66]利用LbuCas13a、化學修飾的RNA激活劑與TtCsm6結合，開發了一種免擴增快速實現核酸檢測的方法(FIND-IT)，其靈敏度和準確性和實時熒光定量PCR方法一致或更優。該方法將TtCsm6與包含8種不同crRNA的LbuCas13a效應子相結合，不僅可以最大程度地覆蓋多種病毒的突變體，同時也避免了核酸擴增步驟。

3.2 靶標基因的富集與擴增

為了優化CRISPR-Cas系統的檢出下限，經常與核酸擴增方法聯用，比如重組酶聚合酶擴增技術(RPA/RT-RPA)、重組酶介導的擴增技術(RAA/RT-RAA)、環介導等溫擴增技術(LAMP/RT-LAMP)、PCR或RT-PCR等(表1)。如在海洋創傷弧菌的檢測中，RAA與CRISPR-Cas12a聯用方法的檢測靈敏性顯著高于單獨使用CRISPR-Cas12a的檢測方法[55]。在上述的核酸擴增方法中，LAMP屬于60～65 ℃等溫擴增，但易受氣溶膠污染而出現假陽性；RAA和RPA需要25～42 ℃反應，研發價格高于LAMP；而PCR需要依賴設備且擴增時間長于其他方法[1]。因此，在病原體檢測技術開發中，目前最為常用的核酸擴增方法主要是RPA/RAA以及LAMP。

為了進一步縮短反應時間，研究人員開發了一系列不需要核酸擴增的方法。Fozouni等[67]通過設計多個靶向SARS-CoV-2的crRNA建立了不需要核酸擴增的CRISPR-Cas13a檢測方法，該方法可直接用于臨床樣本的檢測，其檢測靈敏性可達100拷貝/μL。除了利用多個crRNA，Nguyen等[68]通過改造修飾單個crRNA如在3′-端和5′-端添加不同長度的ssDNA、ssRNA及硫代磷酸化的ssDNA，可能增加CRISPR-Cas12a的檢測靈敏性。

3.3 終信號的讀取方式

目前，在基于CRISPR-Cas系統的病原體檢測技術研究中最為常用的終信號讀取方式包括：熒光信號、比色信號、電化學信號和側向層析分析(表1)。最具代表性的SHERLOCK和DETECTR方法采用的是基于熒光信號的讀取方式[10-11]，在這種信號讀取的基礎上，更多的研究開發出了利用LED藍光燈、微流控技術、手機、側向層析試紙條等讀取終信號[54,62,67,69]。比色信號是一種基于金納米顆粒的可視化分析方法，其能夠通過顏色變化判斷檢測結果。Hu等[70]基于CRISPR-Cas12a構建了一種磁珠下拉輔助的比色分析法，稱之為M-CDC。這種方法能夠實現對ASFV等病原的特異性檢測，同時這種比色法可廣泛應用于熒光檢測或側向層析分析。電化學信號用于核酸檢測的優勢主要是簡單、價格低廉、特異性高等。目前，基于電化學信號的CRISPR-Cas檢測方法研究主要集中在HPV、人細小病毒(PB-19)、單核李斯特菌等[46,49]。

4 展 望

CRISPR-Cas系統作為新一代的可擴展性診斷技術，開創了分子診斷的新時代。該系統表現出靈敏度高、特異性好、價格低廉、操作簡單，并且可以實現快速即時檢測，在病原體檢測方面展示出巨大的應用潛力。基于SHERLOCK、DETECTR方法的SARS-CoV-2檢測試劑盒在美國相繼獲批，同年中國研發的基于CRISPR-Cas系統的SARS-CoV-2檢測試劑盒也獲批上市。迄今為止，在超過數十種人畜共患病和動物病原體中已開展了SHERLOCK、DETECTR及其相應的優化方法的研究。盡管CRISPR-Cas系統具有多種優勢，其未來的發展仍面臨多種挑戰。如開展臨床樣本的大規模驗證，利用測序或多種成熟的方法來確證檢測結果的準確性；在不犧牲檢測靈敏性的條件下，開發臨床樣本的預處理方法、設計多條crRNA等，優化或免除核酸的提取及擴增；CRISPR-Cas系統在更多病原體檢測方面的臨床應用；建立基于CRISPR-Cas系統的定制型高通量檢測或多病原檢測方法；更多新的Cas同源基因或CRISPR新方法的研發；CRISPR-Cas系統與自動化、人工智能等多學科的交叉。隨著研究的進一步深入，未來CRISPR-Cas系統將會在病原體檢測等領域得到廣泛的應用，并成為強有力的新一代檢測工具。