敲低GINS1基因抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力*

梁 盼，楊艷平，馮國飛，溫文勝，張 哲△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021；2.廣西醫科大學區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021；3.廣西區域性高發腫瘤早期防治研究重點實驗室，南寧 530021）

鼻咽癌（NPC）是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，發病部位多在鼻咽頂部和咽隱窩，以非角化性未分化癌多見。其發病具有地域性，且病因復雜，EB病毒、遺傳和環境是促進NPC發生發展的重要因素[1]。隨著放療、化療及靶向治療手段的發展，近年來NPC的療效已大幅提高，轉移和復發仍是目前NPC 的治療難點[2]。探索與NPC 相關的分子標志物和新的治療靶點，是NPC轉化醫學研究的重要切入點。

GINS（Go,Ichi,Nii,San）復合體是生物DNA復制機制中的組成部分，參與DNA復制的起始和延伸過程[3-4]。其有助于增加DNA底物親和力，使底物特異性結合到MCM亞基上，激活解旋酶（mini-chromosome maintenance,MCM），促進解螺旋[5]。該復合體由4 個亞基組成，包括亞基GINS1（Psf1），GINS2（Psf2），GINS3（Psf3）和GINS4（Sld5）[6]。近年的研究提示，GINS 復合物的高表達與腫瘤患者的不良預后有關[7-8]。GINS1的表達下調在滑膜肉瘤中可抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[9]，在肺癌可抑制細胞的增殖[10]。此外，GINS1的高表達還與肝癌的較強侵襲性表型和不良預后相關[11]。但GINS1在NPC 中的表達尚無相關報道。本研究主要探討GINS1在NPC 中的表達情況及其對NPC 的生物學行為的影響，進一步為NPC分子靶向診斷和治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和主要試劑 NPC 細胞株HONE1來自廣西醫科大學鼻咽癌重點實驗室。DMEM 培養基、KSFM培養基（配套生長因子）、澳洲胎牛血清購自Gibco 公司，轉染試劑Lipofectamine RNAi-MAX Reagent 購自Invitrogen 公司，siRNA 購自BIONEER 公司，逆轉錄試劑盒來自全式金品牌，SYBR Green Master Mix 買自Applied Biosystems 公司，細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測試劑盒購自Dojindo 公司。BCA 試劑盒購自碧云天公司，Nu-PAGETM 4-12%Bis-Tris Gel、Marker、sample buffer（4×）、running buffer（20×）購買于Thermo Fisher Scientific公司。GINS1抗體購自Abcam公司，GAPDH抗體購于Proteintech，二抗購自LI-COR公司。細胞劃痕插件購自ibidi 公司，Transwell 小室來自公司Corning，人工基質膠Matrigel來自BD公司。

1.1.2 組織標本 本次鼻咽部組織標本來自廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科門診就診患者，且已經過病理科確診，黏膜慢性炎的患者15例，未分化型非角化性癌患者20例。所有樣本均經過廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理審查委員會批準（No.2016-KY-050），患者均知情同意。收集患者的相關臨床病理資料，采用美國聯合腫瘤委員會（AJCC）修訂的第8版NPC分期標準，對病例資料進行T分期、N分期及臨床分期。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析 數據集來自NCBI的公共數據庫GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），納入數據集標準：（1）正常組和鼻咽癌組均不少于3例；（2）數據集來源物種為人；（3）包括GINS1的數據。由此納入人的NPC 基因表達譜公共數據集GSE12452、GSE13597、GSE34573、GSE61218、GSE53819 和GSE64634，統計學分析以上數據集中NPC和正常組織GINS1的轉錄水平情況。

1.2.2 細胞培養 永生化人鼻咽上皮細胞系NP69與人NPC 細胞株（TW03、HK1、C666-1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HONE1）分別復蘇接種于KSFM培養基（含0.2%生長因子）、DMEM 完全培養基（含10%新生胎牛血清、1%青—鏈霉素混合液）中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每2～3 d 更換培養液。

1.2.3 HONE1細胞轉染 分2組轉染，一組為轉染陰性對照組（siNC-HONE1 組）轉染無義序列；一組為實驗組（siGINS1-HONE1 組）轉染GINS1的序列。按照Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 說明書操作，待接種的6孔板細胞長至50%～60%融合率時進行轉染，分別將siNC 和siGINS1轉染至6 孔培養板中。6 h后6孔板細胞更換新鮮培養基，繼續培養至24 h，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RTqPCR）、蛋白免疫印跡法（Western blotting）驗證轉染效率，收集細胞進行后續實驗。

1.2.4 RNA 提取和逆轉錄 利用TRIzol 法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，參照逆轉錄試劑盒說明書配置逆轉錄體系，該體系含2 μg Total RNA、1μL Anchored Oligo（dT）Primer、10 μL Reaction Mix、1μL RI Enzyme Mix、1μL gDNA Remover 和對應的RNase-free Water。按照該體系進行逆轉錄，所得cDNA進行后續實驗。

1.2.5 RT-qPCR

采用SYBR Green 法，20 μL 的反應體系，該體系包括無菌去離子水7 μL，基因正向引物1 μL，基因反向引物1 μL，cDNA 1 μL 和SYBR Green 10 μL。反應條件為：95 ℃（預變性）10 min；95 ℃10 s，60 ℃1 min，共40 個循環，所得結果使用2-ΔΔCT方法計算。目標基因為GINS1，上游引物序列為：5’-CAACTGCCTGCCTTCAACGA-3’，下游引物序列為：5’-ATCCGAAGCAAGCGGTCATA-3’。內參基因為GAPDH，上游引物序列為：5’-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3’，下游引物序列為：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGG-3’。

1.2.6 Western blotting 法檢測細胞蛋白水平的表達 收集細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。70 ℃10 min蛋白變性，上樣，使用220 V 電壓電泳至泳道maker 分離至膠底，切膠、轉膜后使用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗過夜后，二抗孵育1.5 h，凝膠成像系統拍照并記錄。Image J 進行灰度值分析，蛋白相對表達量=（目的條帶灰度值－背景灰度值）/（內參條帶灰度值－背景灰度值）。

1.2.7 CCK-8法測定細胞活力

將轉染后的HONE1細胞，離心、計數。取96孔板居中位置，每孔接種細胞數為1 000 個/100 μL 培養基。siGINS1-HONE1 組與siNC-HONE1 組分別設置5個復孔/d，每天同一時段取10 μL CCK-8試劑溶液加入每孔，置于培養箱中孵育2 h，酶標儀450 nm波長處測定細胞吸光度值（OD）值并記錄，連續測定5 d。

1.2.8 劃痕法測定細胞遷移能力 HONE1 細胞轉染24 h后，消化、離心、計數。將提前準備好的劃痕插件黏附于6 孔板，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組各5 個復孔。插件小室內接種細胞數為5×104個。待小室細胞貼壁長滿后，移除插件，在六孔板中加入無血清DMEM培養，顯微鏡下觀察劃痕傷口愈合情況，抓拍0 h、8 h 細胞劃痕照片，計算劃痕愈合率。傷口愈合率=（0 h劃痕面積－8 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.9 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將基質膠與無血清DMEM 按1∶29 比例混合稀釋，取100 μL稀釋后的基質膠鋪于Transwell小室上室，放置培養箱1.5 h。轉染后的HONE1 細胞取5×104個接種于上室，下室加入600 μL 含10%血清DMEM完全培養基，細胞培養24 h 后，用4%多聚甲醛固定、1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照，計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，STATA 13軟件進行Meta分析，Image J進行蛋白條帶灰度值分析和劃痕愈合率計算，GraphPad 8.0作圖。計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1GINS1在NPC細胞和腫瘤組織中轉錄上調

在NCBI平臺公共數據庫GEO提取公共數據集GSE12452，GSE13597，GSE34573，GSE61218，GSE53819 和GSE64634，使用兩獨立樣本t檢驗對GINS1轉錄水平的差異性進行分析。結果顯示，與正常組比較，鼻咽癌組中GINS1轉錄水平表達上調，差異均具有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 GINS1在NPC基因芯片中的表達情況

對6個微陣列數據集進行Meta分析，鼻咽癌組包括111 例、正常組包括44 例，見表1。結果顯示，單個數據集存在異質性（I2=61.50%，P=0.02），NPC組織中的轉錄水平高于正常組織（SMD=2.23，95%CI：1.44～3.02，P=0.000），見圖2A。Begg 法（P=0.26）和Egger 法（P=0.38），檢驗結果表明本研究不存在明顯發表偏倚，見圖2B，圖2C。敏感度分析（圖2D）結果顯示，合并標準均差較為穩定，剔除任一研究結果，不會改變結論。

表1 Meta分析中GEO數據集的詳細信息

圖2 GINS1在GEO數據庫NPC芯片數據集中的Meta分析

進一步通過RT-qPCR 技術，檢測了GINS1在NPC 細胞系和組織轉錄水平的差異，結果顯示，對比正常鼻咽上皮細胞系NP69，基因GINS1在NPC細胞系中轉錄上調（P＜0.05）（圖3A）；對比正常組織，GINS1基因在癌組織中呈轉錄上調（P＜0.01），圖3 B、圖3 C。

圖3 GINS1在NPC細胞和組織中轉錄水平表達情況

進一步分析GINS1的轉錄水平與患者臨床病理特征的關系，GINS1的轉錄水平在患者的年齡、性別、T分期、N分期及臨床分期中差異沒有統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉錄水平與NPC 患者相關臨床病理參數的關系

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉錄水平與NPC 患者相關臨床病理參數的關系

2.2 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的增殖能力

沉默GINS1后細胞中GINS1轉錄水平和蛋白水平表達降低，見圖4 A～圖4C。通過CCK-8 法檢測細胞貼壁后第1、第2、第3、第4、第5 天的OD 值，繪制生長曲線，結果顯示，與siNC-HONE1 組相比，siGINS1-HONE1 組第3、第4、第5 天細胞的吸光度值明顯降低，差異具有統計學意義（均P＜0.05），見圖4D。

圖4 沉默GINS1抑制NPC細胞增殖能力

2.3 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的遷移能力

劃痕結果顯示，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組細胞劃痕愈合率分別為（0.61±0.14）、（0.75±0.12），siGINS1-HONE1 組劃痕愈合率低于siNC-HONE1 組，差異具有統計學意義（t=2.22，P＜0.05），見圖5。

圖5 沉默GINS1抑制NPC細胞的遷移能力

2.4 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的侵襲能力

Transwell 侵襲實驗顯示，siNC-HONE1 組穿膜細胞數為每視野（23±19）個，siGINS1-HONE1 組穿膜細胞數為每視野（113±25）個，兩組細胞數比較，差異具有統計學意義（t=4.91，P＜0.05），見圖6。

圖6 沉默GINS1抑制NPC細胞的侵襲能力

3 討論

GINS1是GINS 復合體家族成員的一種亞基，是SLD5的伴侶，其在進化上是保守的，參與了低等真核生物[12-13]和人類的DNA復制過程[14]。GINS1是近幾年的研究熱點，大多情況下，該基因在腫瘤中表達上調，具有一定的腫瘤組織靶向性。本研究發現，GINS1在GEO 數據庫NPC 芯片中轉錄上調。通過RT-qPCR檢測，GINS1在NPC細胞系及組織中mRNA表達水平高于正常鼻咽上皮細胞及組織，結果與GEO 數據庫一致。提示GINS1可能是促癌基因。

本課題使用siRNA 干擾技術沉默細胞HONE1中基因GINS1表達后，通過CCK-8 法檢測到si-GINS1-HONE1 組細胞的增殖能力明顯受到抑制。Tang 等[9]的研究發現，在滑膜肉瘤腫瘤中，下調GINS1的表達，可明顯抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。Li等[15]發現，在肝癌中，下調GINS1可導致G1/S 期腫瘤細胞周期阻滯，進而降低腫瘤細胞的增殖能力。再者，Zhang等[10]的研究表明，敲低GINS1的表達后，肺癌細胞的增殖能力被抑制。本研究證實敲低GINS1后，可在體外抑制NPC 細胞的增殖，進一步證明GINS1有抑制腫瘤增殖的作用。

遷移和侵襲是腫瘤細胞重要的惡性生物學行為，亦是臨床上促使癌癥發展，造成死亡的主要原因。鑒于此，本研究使用劃痕和Transwell實驗檢測沉默GINS1的NPC細胞的遷移和侵襲能力，結果提示：沉默GINS1的表達，可以抑制鼻咽癌細胞的遷移侵襲能力。Saifei等[16]研究發現，沉默GINS2可以抑制甲狀腺癌MAPK通路過度激活的狀態，抑制該信號通路的相關蛋白表達，比如JNK、ERK 和p38，降低甲狀腺癌細胞的活力、遷移和侵襲功能。Dianmin 等[17]研究發現，下調GINS2增加了STAT1 和STAT2蛋白的表達，抑制肺癌的增殖和遷移。此外，Yang 等[18]研究指出，GINS4在非小細胞肺癌中高表達促進了細胞的遷移和侵襲能力。GINS 復合物亞基之間有著密不可分的關系，GINS2、GINS4在其他腫瘤當中的作用也提示著GINS1在NPC 中也可能是異常生物學行為發生的重要因素之一。本研究也證實了，沉默GINS1抑制NPC 遷移和侵襲能力，說明GINS1可能在NPC 的發生發展中起著重要作用。

綜上，GINS1在NPC中呈現轉錄上調，通過siRNA 敲低GINS1的表達，可以顯著抑制NPC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明，GINS2在腫瘤中可通過MAPK/ERK 通路、STAT 信號通路影響腫瘤的增殖和遷移[16-17]。因此，筆者假設，與GINS2同為GINS 家族的GINS1，也有通過MAPK/ERK 通路、STAT 信號通路影響NPC 惡性生物學行為的可能性，這也是本課題下一步的研究方向。闡明相關機制，本課題組能更好的了解GINS1基因作為癌基因的作用，為NPC的診斷和防治提供新的靶點。