FOXM1通過影響PI3K-AKT通路介導彌漫大B細胞淋巴瘤阿霉素耐藥的產生*

張 瑞，羅 彬，劉安貴，周圣圣，彭志剛，馬 劼

（廣西醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，南寧 530021）

彌漫性大B 細胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤最常見的亞型，約占非霍奇金淋巴瘤的30%[1]。目前，利妥昔單抗聯合環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松（R-CHOP）被認為是改善DLBCL患者預后的標準一線治療方案，明顯提升了患者的10年總生存期。然而，仍有部分接受R-CHOP方案治療的患者出現了復發。30%～50%對R-CHOP有原發性或繼發性耐藥的患者的生存預后明顯較差，中位總生存期僅約6.3 個月[2-3]。目前已有R-CHOP耐藥的相關研究[4]，但耐藥機制仍未完全闡明。

阿霉素廣泛用于人類多種惡性腫瘤的治療，對各個細胞周期的腫瘤細胞均有殺滅作用。臨床上用于治療急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤等[5]。在DLBCL，阿霉素是R-CHOP 方案的重要組成部分。因此，研究DLBCL 對阿霉素的耐藥機制具有重要的臨床意義。為了系統地研究DLBCL 中阿霉素的耐藥機制，本研究在DLBCL細胞系中進行了測序分析，這些細胞系在長期暴露后獲得了對阿霉素的耐藥性。通過對耐藥相關的測序數據進行轉錄組和表觀遺傳的綜合分析，初步揭示與DLBCL 耐藥相關的信號通路和關鍵調控因子。

1 材料與方法

1.1 阿霉素耐藥細胞株的培養及測序分析 DLBCL耐阿霉素細胞株是通過對阿霉素敏感的DLBCL細胞系在阿霉素低濃度梯度遞增培養法誘導產生的[6]。取對數生長期的DLBCL細胞，分別加入阿霉素（濃度為0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.04 μmol/L、0.06 μmol/L、0.08 μmol/L、0.10 μmol/L、0.12 μmol/L），誘導7 個月，最終得到耐藥細胞株。使用0.08 μmol/L阿霉素分別處理耐藥細胞株和對照組細胞，對照組細胞包含兩種情況，即不加任何干預的敏感細胞系和0.5%DMSO 干預的細胞系對照。分別于24 h、48 h、72 h檢測阿霉素對DLBCL細胞和耐藥細胞株形態、增殖、凋亡的影響，耐藥細胞在阿霉素刺激下，其細胞活力、細胞凋亡指標等與對照組DLBCL細胞比較均無明顯差異，則說明阿霉素耐藥細胞株構建成功。分別對阿霉素耐藥細胞株和阿霉素敏感細胞株進行測序分析。通過耐阿霉素細胞和親本細胞測序，獲得基因表達矩陣，使用DEseq2 包進行差異表達分析，差異表達篩選標準為|log2FC|≥1且P＜0.05，獲得的差異基因被認為是潛在的耐藥相關基因。

1.2 公共數據集的獲取 在GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫中篩選DLBCL相關的數據集，檢索式為Diffuse large B cell lymphoma OR DLBCL。納入條件：（1）研究僅針對人類；（2）提供的樣本包含DLBCL 組織和正常淋巴組織，且樣本量＞3；（3）能獲取原始表達數據或表達矩陣數據。基 于TCGA 和Genotype-Tissue Expression（GTEx）數據評估耐藥相關基因在DLBCL 中的表達水平。將提供生存狀態及生存時間的數據集單獨篩選出來，用于評估耐藥相關基因與DLBCL 患者預后的關系。

1.3 信號通路分析 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是一個常用的信號通路分析網站，可同時實現GO和KEGG分析。GO分析包括分子功能、生物學過程及細胞組分分析。KEGG分析用于注釋一系列基因涉及的代謝通路。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計算GEO 數據庫獲得的表達數據，用于評估耐藥相關基因在DLBCL中的表達；Stata 12.0 用于合并每個GEO 數據集的結果。采用Graphpad Prism 8.0軟件進行生存分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 彌漫大B 細胞淋巴瘤阿霉素耐藥相關基因的識別 經過測序分析，獲得耐藥細胞株和不耐藥細胞株的基因表達譜數據。對基因表達譜數據進行差異分析獲得耐藥細胞組和非耐藥細胞組之間的差異基因，這些基因在阿霉素耐藥發生過程中失調，被認為可能是阿霉素耐藥相關基因。通過分析未經處理的親代細胞和耐藥細胞中生成的基因表達譜，發現相對于未經處理的親代細胞，耐藥細胞中有2 186個上調基因和725個下調基因；通過分析經過0.5%DMSO 處理的親代細胞和耐藥細胞中生成的基因表達譜，發現相對于0.5%DMSO處理的親代細胞，耐藥細胞中有1 494個上調基因和210個下調基因；分別將上調的基因進行交集，最后共獲得900個上調基因，見圖1。

圖1 彌漫大B細胞淋巴瘤阿霉素耐藥相關基因的鑒定

2.2 淋巴瘤阿霉素耐藥相關信號通路分析 本研究對通過測序數據計算得到的900個耐藥相關基因進行信號通路分析，結果發現PI3K-Akt、細胞黏附分子（Cell adhesion molecules，CAMs）等信號通路顯著富集。這些信號通路與腫瘤耐藥相關[7-9]。其中PI3K-Akt 信號通路在多篇文獻中被報道與DLBCL R-CHOP耐藥相關[10-12]。本研究發現有25個基因富集在這條通路中，包括FLT1、ITGB5、LAMC3、LAMA3、ITGA2B、JAK3、PCK2、ANGPT4、LAMB3、ITGA1、PPP2R3A、NGF、VEGFA、COL1A1、COL2A1、COL5A1、PPP2R2B、IL2RA、KIT、IL2RB、ITGA7、ITGA6、SGK1、EPHA2、CREB5，見圖2。

圖2 富集在PI3K-Akt信號通路中的基因

2.3 調控耐藥的關鍵轉錄因子 為了闡釋調控阿霉素耐藥的轉錄調控機制，KnockTF（http://www.licpathway.net/KnockTF/）被用來預測可能調控900個耐藥相關基因的轉錄因子，取P＜0.05 作為納入的條件，結果發現共223 個轉錄因子參與調控耐藥相關基因，其中排在前5 名的是FOXM1、TP63、FOXP1、NR2F2、PTBP1，見表1。預測調控富集在PI3K-Akt信號通路中的25個基因的轉錄因子，發現共有169 個轉錄因子參與調控這些基因，其中排在前5 名的是TP53、FOXM1、MITF、PTBP1、TP63，見表2。FOXM1、TP63、PTBP1 可能通過PI3K-Akt 信號通路參與調控DLBCL阿霉素耐藥的發生，見圖3。

圖3 調控阿霉素耐藥的潛在轉錄因子

表1 參與調控阿霉素耐藥相關基因的轉錄因子

表2 調控富集在PI3K-Ak信號通路中的基因的轉錄因子

2.4 FOXM1 為調控DLBCL 阿霉素耐藥的關鍵轉錄因子 通過STRING評估3個轉錄因子是否存在相互調控，結果發現均不存在相互調控，提示FOXM1、TP63、PTBP1 可能獨立調控阿霉素耐藥產生（圖4A）。基于GEO數據庫，評估FOXM1、TP63、PTBP1 在DLBCL 中的表達水平。本研究共納入6個數據集，包括GSE9327、GSE12195、GSE23647、GSE25638、GSE32018、GSE43677。納入的數據集均包含DLBCL 樣本和正常樣本的基因表達譜，結果發現FOXM1和PTBP1在DLBCL中呈高表達（圖4B、圖4C、圖4D）。

圖4 評估阿霉素耐藥的潛在轉錄因子在DLBCL中的表達水平

進一步評估FOXM1 和PTBP1 是否與DLBCL患者的生存密切相關，共基于6 個數據集分別計算FOXM1和PTBP1在DLBCL中的風險值，這些數據集包括GSE10846、GSE21846、GSE32918、GSE34171、GSE53786、GSE57611。Meta 分析合并了HR值，發現FOXM1 與DLBCL 預后不良密切相關，見圖5。FOXM1 在耐藥細胞株中無差異表達，由此推測，FOXM1可能并不是通過自身表達的失調來調控耐藥基因的表達，從而介導耐藥的產生。

圖5 FOXM1與DLBCL患者總生存率的關系

2.5 FOXM1 通過PI3K-Akt 信號通路調控阿霉素耐藥的產生 基于以上研究，初步推測FOXM1 可能是通過PI3K-Akt 信號通路調控阿霉素耐藥的產生。分析FOXM1 shRNA 慢病毒轉染24 h 的伯基特淋巴瘤細胞表達譜和使用非靶標對照shRNA 慢病毒轉染24 h的伯基特淋巴瘤細胞的表達譜，結果發現沉默FOXM1 后，有712 個基因發生了表達變化，通過信號通路分析發現這些基因顯著的富集在PI3K-Akt 信號通路中。因此，沉默FOXM1 后會影響PI3K-Akt信號通路通路的作用，見圖6A、圖6B。

2.6 FOXM1 靶基因的鑒定 為了進一步明確FOXM1 在介導阿霉素耐藥過程中的潛在靶標，將900 個耐藥相關基因和沉默FOXM1 后表達顯著改變的711 個基因取交集，最終獲得31 個交集基因，包括TXK、CLCA1、GPR18、LSR、VCAN、RTN1、CD52、NDRG1、PPFIA4、IRF5、CD37、PLAU、SRGN、SCNN1A、CTH、LHFPL2、PLA2G1B、RPS6KA2、SEMG1、F13A1、COLGALT2、PTGES、OPTN、SORBS1、ITGA6、SLC18A2、TPM2、ABCG2、PTPRD、ASNS、SLC16A2。其中ITGA6 是唯一位于PI3K-Akt 信號通路中的基因，且與FOXM1 呈正相關關系，見圖6C、圖6D。據此推測ITGA6是FOXM1在調控阿霉素耐藥中的靶基因。

圖6 FOXM1靶基因的探索

3 討論

由于DLBCL本身的高異質性，即使60%～70%的患者可以在一線治療中獲益，但仍有不少患者出現治療耐藥。目前報道的耐藥機制主要包括3種觀點。第一，DLBCL 是一種高度異質性的疾病，患者間和患者內的腫瘤異質性包含各種遺傳或表觀遺傳修飾，在治療之前或期間獲得的這種空間和時間多樣性導致耐藥性的發生；第二，腫瘤微環境中的浸潤性免疫細胞和基質細胞通過改變腫瘤免疫環境和防止細胞凋亡，在介導治療耐藥性方面發揮重要作用；第三，宿主特異性因素導致的不同個體患者之間的差異引起高度可變的治療反應[13]。

研究發現，R-CHOP 中的5 種藥物具有非常低的交叉耐藥性，說明這5 種藥物的耐藥機制可能并不一致。有研究通過這些藥物長期干預獲得RCHOP耐藥的DLBCL細胞系，在這些細胞系中發現干性相關轉錄因子SOX2 的上調，并且通過PI3K/AKT通路介導耐藥的產生。體內試驗發現，PI3K抑制劑聯合R-CHOP能顯著延長攜帶這些抗性細胞小鼠的存活時間[10]。質譜成像揭示了耐藥的DLBCL中脂質和代謝譜的分子特征，在耐藥樣品中鑒定出更高水平的磷脂酰肌醇和鞘磷脂片段以及減少的三磷酸腺苷和增加的單磷酸腺苷[14]。

本研究重點關注阿霉素耐藥相關的分子調控機制，構建了DLBCL阿霉素耐藥的細胞模型，通過測序分析鑒定出阿霉素耐藥相關的基因，并對這些基因進行信號通路分析，發現這些耐藥基因主要在PI3K-AKT 通路中顯著富集。據此推測PI3K-AKT通路是阿霉素耐藥涉及的關鍵信號通路。轉錄調控分析發現FOXM1可以調控68.3%的耐藥基因，提示FOXM1在介導阿霉素耐藥過程中重要作用。為了證明FOXM1 是否是通過影響PI3K-AKT 通路介導阿霉素耐藥的產生，本研究也探索了調控富集在PI3K-AKT 通路中的基因的轉錄因子，結果發現FOXM1 仍然是處于顯著地位的。此外，在非霍奇金淋巴瘤細胞中沉默FOXM1 的表達，在沉默FOXM1 的細胞株中發現了廣泛的基因表達異常，信號通路分析發現這些基因主要富集在PI3K-AKT通路中，由此認為FOXM1是通過影響PI3K-AKT通路介導阿霉素耐藥的產生。

FOXM1 是參與細胞增殖的轉錄激活因子。在人類惡性腫瘤中，FOXM1 與耐藥的關系被廣泛的報道[15-16]。研究表明，FOXM1在胃癌細胞中呈高表達，且與胃癌患者對紫杉醇和順鉑的耐藥性相關[17]。FOXM1 通過上調NUF2 表達干擾PI3KAKT-mTOR信號通路，調節自噬使膠質瘤細胞對替莫唑胺產生耐藥性[18]。在肺癌中，FOXM1變異通過激活非小細胞肺癌wnt/β-catenin信號通路導致吉非替尼耐藥。FOXM1 通過調控ABCC5 基因轉錄促進宮頸癌細胞耐藥[19]。在DLBCL中，目前尚無文獻報道FOXM1與R-CHOP方案耐藥有關。本研究首次提出FOXM1在介導DLBCL耐藥中的關鍵作用，將為進一步深入研究奠定基礎。涉及耐藥相關的信號通路也有廣泛的報道，其中PI3K-AKT 通路在多種人類腫瘤中被報道與耐藥有關。例如，HIF-1α調節的stanniocalcin-1 通過PI3K-AKT 信號通路介導胰腺導管腺癌對吉西他濱的耐藥性[20]。姜黃提取物通過TLR4-PI3K-Akt-mTOR 通路逆轉結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性[21]。敲低CXCR4 通過PI3K-Akt-mTOR 通路增強紫杉醇在卵巢癌中的敏感性[22]。C2orf40 通過影響細胞周期和激活PI3KAKT-mTOR 信號通路抑制轉移并調節鼻咽癌細胞的化療耐藥和放療耐藥[23]。

綜上所述，PI3K-AKT 通路是參與腫瘤耐藥的關鍵信號通路，FOXM1可能通過影響PI3K-AKT通路介導阿霉素耐藥的產生。本研究仍然存在不足：第一，尚且缺乏更深入的體內、體外試驗證明FOXM1 在DLBCL 耐藥中的重要作用；第二，本研究采用其他非霍奇金淋巴瘤細胞系的數據研究沉默FOXM1后基因表達變化情況，代表性存在不足。