利用七氯對斑馬魚多巴胺神經元毒性影響構建帕金森病模型*

成慧靈，周 美，許 茜，蔡 晶

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州 350122；3.福建師范大學生命科學學院 發育與神經生物學福建省高校重點實驗室，福州 350117）

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是目前僅次于阿爾茨海默病（alzheimer's disease，AD）的第二大神經系統退行性疾病[1-4]。其病理改變多見為黑質部位多巴胺（dopamine，DA）神經元缺失并伴有進行性震顫、動作延緩、肌肉僵硬和步態異常等表現[5-7]。目前，PD運動功能障礙與紋狀體內DA神經元數量的減少有著緊密的關系[8]。有報道，七氯（C10H5CL7，heptachlor）是一種有機氯化合物，具有較強毒性，近年來也被人們廣泛用于農作物地下害蟲的防治。但因其高度的親脂性可富集在動物體內脂肪中，特別是魚類和軟體動物體內多見，且含量達到其生存水體中七氯含量的200～37 000 倍。另外，關于七氯相關化合物的研究可能涉及多種機制，但這些化合物的共同特點是性質穩定且不易降解，可以通過食物鏈積累生物從而進入人體，尤其是部分乳制品被認為是人類接觸農藥的主要來源[9-10]，長期使用可能會導致人腦黑質中DA 神經元的損害，故被認為一直與PD 的病理機制有關。因此，本實驗將首次嘗試用七氯制備PD模型，以期為PD的病因和發病機制的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取的成年野生型AB 斑馬魚（zebrafish）飼養于福州百維斯生物科技有限公司斑馬魚養殖系統中，將雌雄斑馬魚分別飼養在標準溫度28 ℃、光照14 h、黑暗10 h的環境下，并于每天上午9點和下午5 點喂食2 次鹽水蝦。本次動物實驗研究屬于低等動物，是在充分的動物護理和使用指南下進行的，符合國家實驗動物管理條例。

1.2 藥品、試劑及儀器

七氯溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，H298702-1 mL）；6-羥基多巴胺（6-OHDA）（上海源葉生物科技有限公司，S30042-100 mg）；1X E3培養液（福州百維斯生物科技有限公司自制，60X E3培養液配制方法：NaCl 344 mg、KCl 15.2 mg、CaCl2·2H2O 58 mg、MgSO4·7H2O 98 mg，溶于60μL 0.01%的亞甲藍中，定容至20 mL）；三卡因甲基磺酸鹽（美國Sigma 公司，MS-222）；甲基纖維素（上海索萊寶生物科技有限公司，M8070）；trizol RNA 分離試劑盒（中國南京Vazyme 公司，R401-01）；逆轉錄試劑盒（中國南京Vazyme 公司，R123-01）；熒光定量PCR 試劑盒（中國南京Vazyme 公司，Q311-02）；斑馬魚飼養養殖系統（福州百維斯生物科技有限公司）；光照培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，THZ-100）；一體式熒光顯微鏡（尼康，SMZ800N）；實時熒光定量PCR 儀（東勝興業，ETC811）；4 ℃離心機（Scilogex）；qPCR儀（Archimed）。

1.3 動物處理

當次日需使用卵時，于前一天下午4～5點左右，將體型正常且性成熟的斑馬魚以1∶1或1∶2的雌雄比例放入裝有胚培養水的玻璃缸中，并用白色透明隔板隔開。次日上午9 時，取出隔板，進行交配產卵，在5 h 后分缸收集胚胎。先將胚胎用胚培養水清洗3次，然后收集到干凈且無菌的培養皿中，同時利用解剖顯微鏡挑選優質胚胎，選出發育正常至囊胚期的胚胎，每孔30枚，放于6孔板中，然后隨機分為正常對照組、750 μmol/L 6-OHDA 組和七氯組。關于七氯殺蟲劑對人體的有害劑量，有研究[11]通過食用安全性分析為0.5μg/kg·d-1。根據人-斑馬魚體表面積比，換算后設計七氯溶液劑量范圍為0.08～1 mg/L。在0.08～1 mg/L 劑量范圍對藥物濃度最佳劑量進行探索，培養體系為4 mL，設置5 個濃度梯度即每孔分別為1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL七氯組，每孔設計3個復孔取均值。每天給藥1 次，統計并丟棄死卵，連續5 d，將給藥后的胚胎放于28 ℃恒溫光控培養箱中進行培養，連續曝光120 h。

1.4 指標測定

1.4.1 斑馬魚死亡率、畸形率和形態學的檢測

斑馬魚發育情況可以通過是否畸形和形體異常來體現。先鏡下觀察幼體心臟有無跳動和形體是否發黑，若心臟停止跳動和形體已發黑，則確認死亡。每24 h 記錄不同濃度下斑馬魚胚胎死亡和畸形的數目，計算幼體累積死亡率（24～120 hpf）和畸形率（24～120 hpf）。

每組隨機選取10 條魚，用濃度為40 mg/L 三卡因將幼蟲麻醉，后加入纖維素固形，然后鏡下觀察并拍攝形體異常改變，包括心包水腫、卵黃囊吸收延遲、弓背彎曲、魚鰾有無缺失、體長有無縮短等。

1.4.2 斑馬魚行為學實驗檢測

收集各組120 h 后的幼魚，進行觸尾實驗。先在胚培養水中清洗3 次，然后在常規白色泡沫盒中裝少許胚培養水。每組隨機選取1條幼魚置于胚培養水中，將泡沫盒底部作為記錄區域，確保每條斑馬魚的運動區域都在該區域內，讓斑馬魚適應2～3 min后，將針插在幼魚尾部停留的位置，隨后用另一根針刺激幼魚的尾部進行行為追蹤，直到幼魚停止游動后，立即將針插在尾部，進行3次重復。用標尺測量各組幼魚游動的直線距離，記錄每次數據。

1.4.3 斑馬魚凍存方法

行為學實驗結束后，收集各組120 h 后的幼魚。先用蒸餾水清洗3次，后分組裝入1.5 mL EP管中，并用針管將EP 管中的水吸干，然后在每管中加入500 μL trizol，將樣品放于-80 ℃冰箱儲存，以防止RNA降解，影響后續的實驗結果。

1.4.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測斑馬魚DA神經元相關基因表達

從-80 ℃冰箱中取出120 hpf 下的幼魚，按照組織總分離試劑盒說明書提取樣品總RNA。將各組RNA樣品逆轉錄為cDNA，反應設置：第一步50 ℃，15 min，第二步85 ℃，2 min，得到的產物cDNA作為RT-qPCR 模板可立即用于qPCR SYBR Green Master Mix。擴增反應設置：第一階段：預變性，95 ℃，30 s，1 個循環；第二階段：循環反應：95 ℃，10 s,60 ℃，30 s，40 個循環；第三階段：融解曲線：95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，1 個循環，并收集退火后的熒光信號。每個樣品設計3 個復孔，利用公式2-△△CT計算得到實驗數據，見表1。

表1 PCR引物的序列及產物長度

1.5 統計學方法

用SPSS 24.0 軟件對記錄數據進行統計學分析。用GraphPad Prism 8.0 軟件進行作圖。計數資料采用χ2檢驗。計量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD 法；方差不齊則采用Games-Howell 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組斑馬魚死亡率、畸形率及發育形態改變情況

與正常對照組比較，在24～120 hpf 時，6-OHDA組死亡率升高（P＜0.05），1～100 ng/mL 七氯組死亡率差異無統計學意義（P＞0.05），1 000～10 000 ng/mL 七氯組死亡率升高（P＜0.05）；與6-OHDA 組比較，在24～120 hpf 時，1～1 000 ng/mL 七氯組死亡率降低，但10 000 ng/mL 七氯組死亡率升高（P＜0.05），見圖1A。

與正常對照組比較，在72～120 hpf 時，6-OHDA組畸形率升高（P＜0.05），1～100 ng/mL 七氯組畸形率差異無統計學意義（P＞0.05），1 000～10 000 ng/mL 七氯組畸形率升高（P＜0.05）；與6-OHDA 組比較，在72～120 hpf 時，1～1 000 ng/mL 七氯組畸形率降低，但10 000 ng/mL 七氯組畸形率升高（P＜0.05），見圖1B。

圖1 各組斑馬魚胚胎生長情況的比較

正常對照組（單體和群體）斑馬魚器官發育正常且體長清晰可見。與正常對照組比較，在24～48 hpf 時，6-OHDA組和1～10 000 ng/mL七氯組幼體均無明顯變化；在72～120 hpf 時，6-OHDA組幼體出現色素分布不均勻和脊柱彎曲，1～100 ng/mL 七氯組幼體無明顯變化，1 000～10 000 ng/mL 七氯組幼體出現色素沉著分布和脊柱彎曲，10 000 ng/mL 七氯組幼體還出現心包水腫、邊界模糊、體長縮短、脊柱重度彎曲畸形，甚至造成死亡，見圖2A、圖2B。

圖2 各組斑馬魚胚胎發育情況的比較

2.2 各組斑馬魚行為學觀察比較的影響

與正常對照組比較，6-OHDA 組運動距離縮短（P＜0.05），1～10 000 ng/mL 七氯組運動距離縮短（P＜0.05）；與6-OHDA組比較，1～100 ng/mL七氯組運動距離無明顯變化，1 000～10 000 ng/mL 七氯組運動距離更短，其中10 000 ng/mL 七氯組運動距離縮短（P＜0.05），見圖3A。

2.3 各組斑馬魚多巴胺神經元相關基因表達的影響

與正常對照組比較，6-OHDA 組TH2基因表達降低（P＜0.05），1～10 000 ng/mL七氯組TH2基因表達降低（P＜0.05）；與6-OHDA組比較，1 000-10 000 ng/mL 七氯組TH2基因表達更低，10 000 ng/mL 七氯組TH2基因表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 各組行為學和TH2基因表達的比較

3 討論

近年來，6-OHDA藥物作為PD的傳統模型已被廣泛應用，但該模型缺點是不能穿過血腦屏障[12]，故而選擇合適的注射部位是此模型成功的關鍵。目前，斑馬魚作為一種常用的神經科學模式生物，具有與人類相似的神經發育等特點，且無需解剖便可觀察各器官發育情況[13-14]。同時斑馬魚中的基因序列與人腦的基因序列相似度極高[15]。因此，本研究設計在斑馬魚玻璃缸水體中加入已制備完全的七氯溶液來建立斑馬魚PD 動物模型，通過從形態學和行為學方面觀察比較，發現可以較好地表現出人類PD 患者的部分臨床癥狀。另外，與傳統模型相比，該方法死亡率較低，操作簡單便捷，建模周期短，且后期指標檢測取材方便等優勢，也為未來PD藥物的篩選提供了快速而有效的研究手段。

七氯屬于環二烯類殺蟲劑，可以促進大鼠腦細胞內DA神經元中α-突觸核蛋白過度表達從而形成胞內包涵體[16]。研究表明，接觸七氯幾小時后，體內大約20%的七氯就會降解為環氧化七氯，這些化合物會對DA系統造成破壞[17]。同時，毒理學發現，一些殺蟲劑如氨基甲酸酯、有機氯和有機磷酸酯等類物質，會對神經系統造成嚴重損害，即誘導氧化應激、線粒體功能障礙、α-突觸核蛋白原纖維化、神經元細胞丟失，進而逐漸走向細胞凋亡，這些病理改變在一定程度上有助于PD的發生和發展[18-19]。Meta 分析顯示，接觸除草劑、有機磷農藥等物質也是PD 發病的危險因素之一，他們廣泛存在于環境中，能夠選擇性破壞黑質—紋狀體通路中的DA 受體，抑制腺苷三磷酸（ATP）的合成，增加氧化反應的生成[20]，最終引發PD樣病變。

本研究嘗試用七氯誘導的斑馬魚PD 模型，出現了幼體死亡、發育形態畸形、行為動作緩慢和TH2 基因表達異常等改變，說明斑馬魚PD 模型建立成功。隨著藥物濃度的升高，七氯組不僅抑制了斑馬魚發育能力，讓幼蟲的病死數量逐漸增加，而且誘發了體型異常，出現心包腫大、魚鰾缺損、脊柱嚴重畸形、體長縮短等情況，提示七氯可影響斑馬魚的生長發育狀態。行為學顯示，七氯組斑馬魚的運動能力下降，速度減慢，運動距離縮短，產生的神經毒性效應要比6-OHDA 組更明顯，表明PD 斑馬魚的運動障礙。TH2 參與DA 合成，其表達水平與腦內DA 含量呈正相關關系，因此將TH2 含量的表達作為驗證PD 模型是否成功的關鍵[21]。經七氯造模后，TH2 的表達水平下降，提示七氯影響了腦內DA的含量。本實驗結果與之前研究基因表達趨勢相同且相關指標變化符合PD 特征，證實了一種新的可替代傳統方法的斑馬魚PD 模型建立的成功。同時，突出了殺蟲劑七氯在誘導PD 發病中的毒素作用，為七氯的毒理學研究和PD 的臨床治療提供了一定的實驗基礎。

綜上所述，本研究證實了1 000～10 000 ng/mL濃度的七氯溶液最適合建立斑馬魚PD 模型，而且當濃度為10 000 ng/mL 時，斑馬魚表型改變及TH2基因表達變化顯著，其效果與傳統造模試劑6-OHDA 類似，認為是一種PD 造模的合理方法。另外，斑馬魚遺傳操作方便、周期短、產卵多、易飼養，故取培養時間1周為宜。