內質網應激介導心肌細胞線粒體損傷參與肺心病發病機制研究*

單 虎，張 蓉，張秋紅，楊 俠，高 錦，張 潔，李雅莉，張 明△

（1.西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，西安 710004；2.陜西省人民醫院消化內一科，西安 710068）

慢性肺源性心臟病是多數呼吸系統慢性疾病常見的晚期并發癥，它以慢性缺氧、肺動脈高壓、右心擴大和右心衰竭為主要特征[1]。慢性肺源性心臟病尚缺乏有效的特異性治療措施，且患者就診時常因急性呼吸道感染而表現為呼吸衰竭合并右心衰竭，預后極差[2]。因此，探索慢性肺源性心臟病的發病機制，繼而尋找特異性治療措施已成為當前重要的研究熱點。肺泡慢性缺氧等因素誘導的肺動脈高壓一直被認為是慢性肺源性心臟病的主要發病機制，然而直到近年來，慢性缺氧對心肌細胞的直接損傷作用才引起人們的重視[3-6]。現已證實，慢性缺氧可直接造成心肌細胞線粒體功能異常、線粒體自噬、內質網應激（ERS）、心肌細胞肥大和凋亡，其中線粒體和內質網作為心肌細胞重要的細胞器在其中發揮著重要的作用[7-9]。越來越多的研究發現，當機體遭受外界刺激導致內環境穩態失衡無法糾正時，內質網與線粒體通過結構耦聯和交互作用誘導細胞凋亡[10-13]。然而，內質網在慢性缺氧環境下心肌細胞線粒體損傷中所發揮的作用尚未有研究證實。本研究擬利用慢性缺氧大鼠模型探索ERS在慢性缺氧誘發心肌細胞線粒體損傷中的作用及其機制，從而探索慢性肺源性心臟病發病機制及可能的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器試劑 30只8周齡雄性Wistar大鼠（200～250 g）購自西安交通大學醫學部實驗動物中心；氣體濃度控制器購自上海塔望智能科技有限公司；H7650透射電子顯微鏡（日本日立）；721型分光光度儀（上海第三分析儀器廠）；熒光酶標儀（瑞士Tecan公司）；半干轉膜儀（美國Hoefer公司）；手術器械（西安交通大學試劑中心）；高質純化線粒體分離試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司）；組織蛋白裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性測定試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司）；4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA，ERS 抑制劑，美國Sigma 公司）；抗葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司（bs-1219R）；抗CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）兔多克隆抗體購自美國Sigma公司（SAB5700602）；常規試劑均為國產分析純產品。

1.2 實驗分組 動物飼養和處置均符合我國《實驗動物管理條例》的要求，30 只雄性Wistar 大鼠平均分配到6 籠進行適應性飼養，7 d 后，按隨機數字表法將其分為3組：（1）對照組大鼠10只，暴露在空氣中喂養；（2）低氧組大鼠10 只，每天固定8 h 在（10±0.5）%的氧濃度下喂養，籠內氧濃度由氣體濃度控制器（上海塔望智能科技有限公司）控制，其余16 h在空氣中喂養；（3）干預組大鼠10只，喂養方式同低氧組，每天給予0.5 mg/kg 4-PBA混懸液灌胃。對照組和低氧組大鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃。3組大鼠均喂養21 d，并稱重記錄。

1.3 組織取材 用10%醫用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后將其固定于試驗臺上。沿肋弓剪開皮膚及深層腹壁，而后縱行剪開左側肋骨，暴露心臟，在主動脈根部水平剪斷分離心臟，并迅速用4 ℃PBS溶液沖洗心腔內血液至澄清。在冰面上進行心臟各部分分離操作，首先修剪去除心包組織和脂肪組織，然后分別分離心房、右心室（RV）、左心室和室間隔（LV+S），用濾紙吸干后分別稱重。用手術刀切取部分右心室組織置于2.5%戊二醛溶液固定，用于制作電鏡標本，部分右心室組織用于提取線粒體并檢測線粒體膜電位、呼吸鏈酶復合物活性，剩余組織均置于液氮罐中速凍，后轉移到-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 組織病理學檢查 將右心室組織標本放置在2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱過夜，按照電鏡超薄切片制作方法進行脫水、包埋、切片，在透射電子顯微鏡下觀察細胞及線粒體結構。

1.5 線粒體提取 稱取0.5 g左右新鮮右心室組織用于提取線粒體并檢測線粒體膜電位和呼吸鏈復合物活性。根據線粒體提取試劑盒說明書在冰上完成操作，首先用眼科剪將組織剪碎，用PBS 溶液沖洗后轉移到5 mL EP 管，加入2.5 mL 酶解液后冰上孵育10 min，低溫離心機1 000 g離心2 min，棄上清后分別加入1.5 mL 清理液和1 mL 凈化液，震蕩混勻后再次離心棄上清，加入2.5 mL裂解工作液并轉移到玻璃勻漿器中進行勻漿操作30～40 次，再次于低溫離心機以1 200 g離心10 min，轉移上清液到新的EP管，最后使用低溫超高速離心機10 000 g離心10 min，棄上清后所得沉淀物即為新鮮的心肌組織線粒體混懸液，加入0.2 mL預冷的保存液輕柔吹打重新懸浮線粒體，隨即開始檢測線粒體膜電位和呼吸鏈酶復合物活性。

1.6 線粒體功能檢測 在避光環境下使用JC-1 熒光探針用于檢測線粒體膜電位，向新鮮提取的線粒體混懸液中加入0.1 mL JC-1染色工作液，搖勻后置入37 ℃水浴箱孵育20 min，隨后離心棄上清，使用0.2 mL染色緩沖液洗滌細胞2次，每次10 min，最后加入0.2 mL染色緩沖液并懸浮線粒體，使用熒光酶標儀檢測熒光強度（設定激發波長525 nm，發射波長590 nm）。根據SDH活性測定試劑盒說明書進行操作，首先制備反應底物并在37 ℃水浴箱內避光孵育5 min，取0.1 mL 新鮮提取線粒體加入反應底物中，分別在5 s和65 s時讀取600 nm處吸光度值，其差值代表琥珀酸脫氫酶活性。根據COX 活性測定試劑盒說明書操作，設置分光光度儀25 ℃，將0.93 mL緩沖液加入比色皿，加入20 μL 新鮮提取的線粒體混懸液，37 ℃孵育3 min 后放入分光光度儀，加入50 μL 反應工作液并混勻，隨機計時，在反應第0 秒和60 秒分別讀取550 nm 處吸光值，其差值代表COX活性。

1.7 Western blotting 檢測 稱取100 g 右心室心肌組織在冰上剪碎，轉移到研缽進行研磨，再轉移到EP 管中，加入含1%苯甲基磺酰氟的裂解液1 mL，于冰上裂解30 min。裂解結束后于低溫離心機6 500 g 離心20 min，取上清液用Bradford 法進行蛋白定量，加入相應量的上樣緩沖液，在PCR 儀上95 ℃加熱5 min 使蛋白質變性。取等質量蛋白經SDS-PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜，用含10%脫脂奶粉的PBST室溫下封閉2 h，隨后分別用1∶1 000稀釋后的GRP78抗體和1∶2 000稀釋后的CHOP抗體4 ℃冰箱孵育過夜，用1∶20 000稀釋的HRP標記二抗37 ℃搖床孵育2 h。使用ECL發光試劑盒進行顯色，將經過顯影和定影后的X 光膠片晾干保存，統一用凝膠電泳成像分析系統照相，用Image Plus Pro圖像處理軟件進行灰度分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，各組數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心臟右心室質量占比變化 缺氧組大鼠在常壓間歇缺氧環境下飼養21 d過程中，逐漸出現活動減少，進食量減少及生長緩慢等表現，至飼養第21 天時，缺氧組大鼠心臟體質比（心臟質量/體重）、右心室體質比（右心室質量/體重）和右心室占比[右心室質量/左心室+室間隔質量之和，RV/（LV+S）]均高于對照組（均P＜0.001），見圖1。提示缺氧組大鼠出現以右心室肥大為主的心臟肥大表現，證實慢性缺氧誘發的慢性肺源性心臟病模型成功建立。

與缺氧組大鼠相比，干預組大鼠活動量、進食量有所增加，生長緩慢現象有所緩解，至飼養第21 天時，干預組大鼠心臟體質比、右心室體質比和RV/（LV+S）均低于缺氧組，其中以右心室質量及右心室體質比降低最為顯著（均P＜0.05），見圖1。提示4-PBA 干預可以有效防治慢性缺氧刺激誘發的慢性肺源性心臟病。

圖1 慢性缺氧時大鼠心臟形態變化及4-PBA的干預作用

2.2 大鼠右心室心肌組織線粒體結構變化 慢性缺氧刺激下，缺氧組大鼠心肌線粒體出現腫脹變形，線粒體嵴排列紊亂，部分線粒體膜破壞，線粒體結構完整性喪失。干預組大鼠心肌線粒體結構異常相對較輕，線粒體結構完整性良好，未見線粒體膜破壞，見圖2。

圖2 慢性缺氧時大鼠心肌線粒體形態變化及4-PBA 的干預作用（×5 000）

2.3 大鼠右心室心肌線粒體膜電位及呼吸鏈酶復合物活性變化 與對照組相比，缺氧組大鼠心肌線粒體膜電位水平降低，線粒體呼吸鏈中COX 和SDH 酶相對活性均降低（均P＜0.001），見圖3。與缺氧組相比，干預組大鼠心肌線粒體膜電位水平及COX、SDH 酶相對活性均有所升高（均P＜0.001），見圖3。

圖3 慢性缺氧時心肌線粒體功能變化及4-PBA的干預作用

2.4 大鼠右心室心肌ERS 相關蛋白表達變化 與對照組比較，缺氧組大鼠心肌組織ERS 相關蛋白CHOP、GRP78 表達水平上調（均P＜0.001），而4-PBA干預后，干預組CHOP、GRP78表達水平低于缺氧組（均P＜0.001），見圖4。提示慢性缺氧刺激可誘發心肌組織ERS，同步給予4-PBA 可有效降低ERS水平。

圖4 慢性缺氧時ERS相關蛋白表達水平的變化及4-PBA的干預作用

3 討論

心臟是一個對氧氣高度依賴的器官，任何引起機體系統性缺氧的疾病都可能導致心肌組織慢性缺氧，繼而引發心肌收縮功能降低，甚至心力衰竭。因此，探尋慢性缺氧情況下心肌細胞功能變化的機制將為臨床上救治慢性肺源性心臟病等缺氧性心臟病提供新的突破點。

線粒體是維持心肌細胞能量供應的重要細胞器，在慢性缺氧情況下，線粒體首先做出代償性反應。慢性缺氧刺激通過活化氧敏感性轉錄因子上調線粒體相關生物合成，通過增加線粒體數量和增強線粒體呼吸功能的方式，保證線粒體的能量產出，維持心肌組織功能。同時，慢性缺氧刺激心肌細胞產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），上調蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活性，繼而誘導心肌線粒體耐受鈣超載，抑制線粒體通透性轉換孔開放，促進線粒體自噬，防止心肌細胞凋亡。然而，隨著缺氧時間的延長，ROS 積累將誘發氧化應激損傷，通過介導線粒體損傷，促進鈣離子和細胞色素C的釋放，最終導致細胞凋亡[14]。

內質網是心肌細胞中除線粒體外的另一個重要細胞器，主要參與細胞內蛋白質合成、鈣穩態和凋亡的調節。由于線粒體和內質網在調節細胞內鈣穩態和細胞凋亡方面有諸多功能重疊，線粒體－內質網交互作用也逐漸被揭示且已經被證實參與包括炎癥性疾病、腫瘤等多種疾病的發生過程。包括缺血缺氧、氧化應激等在內的應激刺激可誘發內質網折疊蛋白質過程紊亂，同時出現鈣平穩紊亂和未折疊蛋白反應，即ERS。ERS發生后，內質網膜上的轉錄激活因子6（activating transcription factor，ATF-6）、IRE1（inositol-requiring enzyme 1）和PERK（protein kinase R-like ER kinase）分別活化，介導線粒體損傷及細胞凋亡[15]。此外，線粒體－內質網結構耦聯（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM）也為兩者之間鈣離子轉運、信號轉導等交互影響提供物理作用平臺[16]。盡管如此，ERS在慢性缺氧刺激導致心肌細胞線粒體結構和功能異常中所發揮的作用仍未有研究證實，以阻斷ERS為靶點，是否可作為慢性肺源性心臟病的潛在治療方法也需動物實驗來揭示。

本研究通過常壓間歇缺氧法構建慢性肺源性心臟病大鼠模型，結果發現，在肺心病大鼠出現右心室肥大的同時，右心室心肌細胞線粒體膜電位降低，呼吸鏈酶復合物中的關鍵酶COX、SDH 活性均降低，繼而出現線粒體嵴結構排列紊亂、線粒體膜完整性破壞、線粒體腫脹等結構異常。在肺心病大鼠出現心肌組織線粒體結構和功能異常的同時，ERS 標志性蛋白CHOP 及GRP78 表達水平上調（P＜0.001），提示ERS 與線粒體受損同時出現。為了進一步明確ERS與線粒體損傷之間的相互關系，本研究結果結果發現，4-PBA 在抑制ERS 的同時，可以有效地發揮線粒體保護作用，4-PBA 干預大鼠在慢性缺氧環境中線粒體膜電位下降得到改善，線粒體呼吸鏈酶復合物活性有所升高，電鏡下還可以觀察到線粒體結構破壞程度有所緩解，并最終減輕了慢性缺氧導致的右心室肥大。

由此可見，ERS 可能作為線粒體損傷的上游機制參與慢性缺氧誘發慢性肺源性心臟病的發病過程，而且以ERS為作用靶點可以有效減輕慢性缺氧誘發的線粒體損傷和右心室肥大。在阿爾茨海默病、帕金森病等多種疾病模型研究中，線粒體一直被認為在線粒體和內質網交互作用中發揮主體作用，即多種應激刺激引起線粒體產生ROS 增多，通過氧化應激誘使線粒體結構及功能異常，從而激活ERS，最終通過未折疊蛋白反應和鈣穩態失衡影響細胞功能狀態[17-18]。然而，ERS發生后，內質網中儲存的大量鈣離子釋放進入細胞質，可引發線粒體膜通透性轉換孔開放，引發線粒體腫脹，細胞色素C釋放入細胞質，激活線粒體途徑細胞凋亡[19-20]。此外，ERS下游信號通路中的caspase-12活化后可以通過MAM 上內質網蛋白GRP78 與線粒體蛋白VDAC1調節線粒體介導的細胞凋亡[21-22]。

綜上所述，本研究通過動物實驗揭示了慢性缺氧可誘發心肌細胞ERS，繼而引起線粒體功能損傷和結構異常，參與慢性肺源性心臟病的發病過程。明確ERS 介導的線粒體損傷在慢性肺源性心臟病中的作用有助于闡明慢性肺源性心臟病的發病機制，并證實靶向ERS的藥物可以應用于以心肌細胞保護為策略的慢性肺源性心臟病治療中。