過氧化物酶體增殖物激活受體γ在急性缺氧腎損傷大鼠腎臟組織中的表達及其意義*

朱仕群，鄒家森，韋君雨，韋金雙，覃遠漢

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021）

腎臟對缺氧十分敏感，一旦缺氧應(yīng)激不可逆，便會導(dǎo)致腎損傷。腎組織缺氧被認為在多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[1]。研究提示，不同的疾病種類通過改變流經(jīng)腎臟的血流引起的腎臟局部氧的缺失可導(dǎo)致急性腎損傷（AKI）或慢性腎臟病（CKD）[2]。腎臟組織中超氧化物歧化酶（SOD）的消耗程度可反映腎臟組織氧化損傷的程度[3-4]。機體缺氧會導(dǎo)致血管通透性增加、炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多，引起炎性反應(yīng)，而炎性組織又常常因為細胞代謝需求增加和底物不足的共同影響，反過來加重缺氧，二者常并存且互相作用[5]。研究表明，白介素-1β（IL-1β）作為急性炎癥因子參與了缺氧性腎損傷過程[6]。另外，缺氧使腎臟分泌強血管收縮物內(nèi)皮素（ET-1）含量增加，腎血管收縮，更加重了腎缺血，造成腎功能損害[7]。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）屬于Ⅱ型核激素受體超家族成員，其表達分布在腎臟、脂肪組織及免疫系統(tǒng)，參與腎臟的發(fā)育、脂質(zhì)代謝，具有調(diào)節(jié)水鹽重吸收和調(diào)控腎血流量并激活腎素血管緊張素系統(tǒng)等生理功能[8-9]。激活后的PPARγ可抑制黏附分子、趨化因子等炎性相關(guān)因子，抑制炎癥反應(yīng)，還可減少活性氧自由基，減輕氧化應(yīng)激[10-11]。因此，本研究通過建立急性缺氧誘導(dǎo)的腎損傷大鼠模型，運用PPARγ激動劑羅格列酮和抑制劑GW9662干預(yù)PPARγ基因表達，檢測PPARγ受體的表達變化及其與缺氧損傷相關(guān)的指標（IL-1β、ET-1、SOD）的關(guān)系，初步探討其作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6 周齡SPF 級SD 雄性大鼠24 只，體重120～150 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。動物使用許可證號：SYXK 桂2020-0004，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2020-0003。本研究動物實驗操作均符合廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會審查標準。

1.2 動物分組與處理 將24只大鼠隨機分為正常對照組、PPARγ 激動劑組、PPARγ 抑制劑組和缺氧損傷組，每組6只。PPARγ 激動劑組缺氧前3d開始給予羅格列酮10 mg/kg·d-1,腹腔內(nèi)注射，每天1次，共3 d。PPARγ 抑制劑組缺氧前3 d 開始給予GW9662 1 mg/kg·d-1，腹腔內(nèi)注射，每天1次，共3 d。正常對照組不給予任何干預(yù)處理，自由飲食、水。將PPARγ激動劑組、PPARγ抑制劑組和缺氧損傷組大鼠放置于低壓低氧動物實驗艙內(nèi)，艙內(nèi)模擬高度升至7 500 m（氧濃度約為9.0%）。維持模擬艙內(nèi)的環(huán)境溫度（25 ± 2）℃，濕度55%，艙內(nèi)自由飲食、水。缺氧7 h 后處死大鼠，取左側(cè)腎臟組織去除腎包膜和腎筋膜后，一部分置于4%的多聚甲醛中，留做病理。另一部分放于-80℃保存留做后續(xù)實驗。

1.3 腎組織病理學檢查 取出約黃豆大的腎臟不同部位組織，用10%中性福爾馬林固定，按常規(guī)方法制成3～4 μm 厚的石蠟切片，經(jīng)蘇木精—伊紅（HE）染色后，于普通光鏡下觀察。將摘除的左腎側(cè)面剖開，在腎皮質(zhì)上切取直徑1 μm的組織，置3.1%戊二醛固定，經(jīng)緩沖液浸洗，1%鋨酸后固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋后，制出半薄切片。在光鏡下定位，再切成超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鋁雙染，于透射電鏡下觀察。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測腎組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD mRNA 表達 采用NucleoZOL（德國MACHEREY-NAGEL 公司）提取腎組織總RNA，按TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在ABI 7500 型PCR 儀上行PCR 擴增。引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計并合成，序列如下：PPARγ上游：5’-CCATCGAGGACATCCAAGACAACC-3’，下游：5’-GTGCTCTGTGACAATCTGCCTGAG-3’；IL-1β上游：5’-CTCACAGCAGCATCTCGAC-AAGAG-3’，下游：5’-TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC-3’；ET-1上游：5’-TGCTCCTGCTCCTCCTTGATGG-3’，下游：5’-TCGCTTAGACTTAGAAGGGCTTCC-3’；SOD上游：5’-CCACATCGGCCTGTGTATATCCCAG-3’，下游：5’-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG-3’；內(nèi)參β-actin上游：5’-AGTGTGACGTTGACATCCGTA-3’，下游：5’-GCCAGAGCAGTAATCTCCTFCT-3’。PCR 反應(yīng)總體系：上、下游引物各0.4 μL，Mix 10.0 μL，模板2.0 μL，加ddH2O 至20.0 μL。反 應(yīng)條件：95 ℃、30 s，循環(huán)1 次；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40 次；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，循環(huán)1次。采用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.5 Western blotting 法檢測腎組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD 蛋白表達 取腎臟組織，用蛋白裂解液提取總蛋白，將蛋白煮沸變性后取10 μg上樣，行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠泳（SDS-PAGE）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉1.5 h；加入一抗PPARγ（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、ET-1（1∶1 500）、SOD（1∶2 000）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜3 次，10 min/次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000，SAB 公司）室溫孵育1.5 h，洗膜3次，10 min/次；使用Fluo-rChem?HD2成像系統(tǒng)進行掃膜，采用Image J 軟件對結(jié)果進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組間差異比較用單因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理改變 HE 染色顯示，正常對照組大鼠腎臟組織病理無明顯改變。與正常對照組相比，PPARγ 激動劑組、PPARγ 抑制劑組和缺氧損傷組的大鼠均出現(xiàn)RTEC腫脹、脫落；與缺氧損傷組相比，PPARγ 激動劑組大鼠RTEC 腫脹程度減輕，PPARγ 抑制劑組大鼠腎小管可見大量脫落RTEC，見圖1。透射電鏡顯示，與正常對照組相比，另外3組大鼠均有RTEC線粒體腫脹；PPARγ激動劑組與缺氧損傷組相比，大鼠RTEC腫脹減輕，PPARγ抑制劑組大鼠RTEC線粒體嵴較缺氧損傷組與PPARγ激動劑組減少，見圖2。

圖1 大鼠腎臟組織HE染色病理改變（×400）

圖2 大鼠腎小管上皮細胞的透射電鏡圖（×5 000）

2.2 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD mRNA相對表達量比較 與正常對照組比較，缺氧損傷組PPARγ、SOD mRNA相對表達量降低，而IL-1β、ET-1 高；與缺氧損傷組比較，PPARγ 激動劑組PPARγ、SOD mRNA 相對表達量升高，IL-1β、ET-1 mRNA 降低，而PPARγ 抑制劑組情況與PPARγ 激動劑組正好相反，見表1。

表1 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD mRNA相對表達量比較

表1 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD mRNA相對表達量比較

與正常對照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

2.3 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD相對蛋白表達量比較 與正常對照組比較，缺氧損傷組PPARγ、SOD 相對蛋白表達量降低，而IL-1β、ET-1升高；與缺氧損傷組比較，PPARγ 激動劑組PPARγ、SOD 相對蛋白表達量升高，IL-1β、ET-1 降低，而PPARγ抑制劑組情況與PPARγ激動劑組正好相反，見表2，圖3。

表2 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD 蛋白相對表達量比較

表2 各組大鼠腎臟組織PPARγ、IL-1β、ET-1、SOD 蛋白相對表達量比較

與正常對照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

圖3 各組大鼠腎臟組織Western blotting蛋白電泳圖

3 討論

本研究參照Chhabra 等[12]和劉麗麗[13]應(yīng)用的低壓低氧誘導(dǎo)的急性缺氧大鼠腎損傷模型，利用低壓低氧動物實驗艙制造缺氧狀態(tài)，建立急性缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型。在保證大鼠存活率的同時能較好地排除低壓缺氧外的其他因素對大鼠造成的損傷。HE染色結(jié)果顯示，急性缺氧后的大鼠RTEC腫脹、脫落。透射電鏡顯示急性缺氧后RTEC 線粒體較正常對照組大鼠明顯腫脹。對缺氧性損傷指標的檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，缺氧損傷組大鼠腎臟組織的PPARγ和SOD 的mRNA及其蛋白表達水平均顯著降低，而IL-1β 和ET-1 的mRNA 及其蛋白表達水平均顯著增高。提示模型構(gòu)建成功。

激活后的PPARγ可抑制炎癥通路，下調(diào)炎癥因子表達，減少活性氧自由基，減輕氧化應(yīng)激[10-11]。小鼠敲除PPARγ基因后出現(xiàn)腎功能不全，肌酐清除率降低，伴有纖維化和腎小管擴張[14]。研究報道，在缺血再灌注損傷大鼠中，PPARγ 激動劑通過上調(diào)PPARγ 表達，增加機體抗氧化能力，從而減輕腎損傷[15-16]。在缺氧/復(fù)氧模型中受損RTEC的PPARγ表達被抑制[17]。本研究中，PPARγ激動劑組大鼠RTEC腫脹較缺氧損傷組的減輕，PPARγ 抑制劑組大鼠RTEC線粒體嵴較缺氧損傷組及PPARγ激動劑組減少，提示PPARγ 表達水平的變化可能與腎損傷有關(guān)。

SOD 是機體最重要的抗氧化酶，參與維持細胞完整性和代謝過程，腎組織中SOD的消耗程度反映腎組織氧化損傷的程度。有研究表明，在順鉑誘導(dǎo)的肝損傷模型中，SOD 活性降低，肝臟PPARγ 表達降低[18]。急性缺氧迅速激活內(nèi)皮細胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)[19]。IL-1β是最常見的促炎因子，它們在炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用。腎小管損傷后可通過炎癥反應(yīng)直接使血管內(nèi)皮細胞受損，也可通過腎小管細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（如IL-1β）使內(nèi)皮細胞功能受損。呼吸道滴注脂多糖的方式建立小鼠急性肺損傷模型中，激活PPARγ可使IL-1β的水平降低[20]。PPARγ激動劑能夠抑制IL-1β 誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞對植物血凝素樣受體1表達而發(fā)揮抗炎作用[21]。ET-1是由血管內(nèi)皮細胞、支氣管黏膜上皮細胞分泌，具有較強的縮血管活性，缺氧可使ET 合成增加。已知腎血管對ET 的縮血管效應(yīng)比其他血管床敏感10倍。有研究報道，PPARγ 敲除小鼠ET-1 的分泌增加[22]。上述研究提示，PPARγ 表達異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PPARγ 可能通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化損傷對腎損傷具有保護作用。

本研究結(jié)果顯示，HE 染色與透射電鏡均可見：與正常對照組相比，經(jīng)過急性缺氧的PPARγ激動劑組、PPARγ 抑制劑組和缺氧損傷組的大鼠腎臟組織均出現(xiàn)損傷。PCR 和WB 結(jié)果顯示：與正常對照組比較，缺氧損傷組大鼠腎臟組織的PPARγ 和SOD的mRNA 及其蛋白的表達水平均降低，而IL-1β 和ET-1 的mRNA及其蛋白的表達水平均升高，提示急性缺氧導(dǎo)致的大鼠腎臟組織PPARγ 表達水平的降低可能與急性腎損傷有關(guān)。

為了探討PPARγ 在大鼠急性缺氧性腎損傷發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究采用PPARγ激動劑羅格列酮和抑制劑GW9662 對急性缺氧性腎損傷大鼠PPARγ 基因進行干預(yù)，結(jié)果顯示，與缺氧對照組比較，PPARγ 激動劑組大鼠腎臟組織HE 染色與透射電鏡均顯示腎臟損傷程度減輕，腎臟組織PPARγ和SOD的mRNA及其蛋白表達水平均升高，而腎臟組織IL-1β 和ET-1 的mRNA 及其蛋白表達水平均降低；相反，PPARγ抑制劑組大鼠腎臟組織HE染色與透射電鏡均顯示損傷程度加重，腎臟組織PPARγ和SOD的mRNA及其蛋白表達水平均降低，而腎臟組織IL-1β 和ET-1 的mRNA 及其蛋白表達水平均增高。以上結(jié)果提示，上調(diào)PPARγ的基因表達可以減輕急性缺氧性大鼠腎損傷，而下調(diào)PPARγ的基因表達則加重急性缺氧性大鼠腎損傷。

綜上所述，在急性缺氧腎損傷大鼠中，腎臟組織PPARγ 的表達顯著降低并參與了腎損傷，PPARγ激動劑羅格列酮可減輕大鼠缺氧性腎損傷，而PPARγ 抑制劑GW9662 則加重大鼠缺氧性腎損傷，其具體作用機制有待進一步探討。