基于Label-free技術的肝癌相關抗原KTN1蛋白質組學研究*

潘 劍，張瑤堯，覃秋紅，陳承曉，黃天明，黃榮師，羅國容Δ

（1.廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021；2.廣西江濱醫院病理科，南寧 530021；3.廣西中醫藥大學基礎醫學院，南寧 530200）

原發性肝癌（primary liver cancer）發病率位居2020年全球癌癥第6位，致死率位居第3位[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發性肝癌主要的病理類型中75%～85%，其發病隱匿，被發現時患者往往已處于晚期且難以治愈，是威脅人類健康的主要因素之一[2]。而肝母細胞瘤（hepatoblastoma，HB）是兒童主要的原發性肝癌病理類型[3]。驅動結合蛋白（Kinectin 1，簡稱KTN1）基因定位于14 號染色體q22.3 上，mRNA 全長約4.6 kb，是驅動蛋白（Kinesin）的內質網膜受體，參與囊泡轉運及膜形態與結構的維持[4]。近年相關研究表明，KTN1基因在細胞內編碼相應蛋白并參與許多疾病的進展，包括神經系統、免疫系統及腫瘤性疾病等[5-7]。課題組前期利用大數據綜合分析73 個數據集的表達數據，明確KTN1 在HCC 中高表達，且可以作為HCC診斷和預后判斷的分子標記物。在HCC 細胞株Huh7 中敲除KTN1 基因，發現Huh7 細胞增殖能力受到抑制，早期和晚期凋亡的細胞數量均顯著增加，同時細胞遷移能力和侵襲能力也顯著下降，同時RNA-seq 檢測了敲除KTN1 基因之后HCC 細胞表達譜的改變，展示了差異基因參與的多個癌癥相關通路[6]。但KTN1影響HCC發生發展中的作用機制尚不清楚。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）主要用于鑒定2種蛋白之間在細胞內是否發生了生理性的結合。非標記定量（label-free）主要用于樣品之間同種蛋白質差異的比較，通過計算肽段的母離子峰來鑒定樣品中的肽段或蛋白質，再對所鑒定的蛋白進行定量分析。本研究利用Co-IP技術在HCC 細胞和正常肝細胞株WRL68 中下拉與KTN1 結合的蛋白，利用label-free 蛋白質組學技術檢測KTN1 相結合的蛋白，分析KTN1 可能影響HCC生物學功能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞 HCC 細胞系Huh7 細胞購自中科院上海細胞庫，肝母細胞瘤細胞系HepG2、正常肝細胞系WRL68細胞和Hela細胞購自武漢金開瑞生物工程有限公司。

1.2 主要的儀器設備與試劑 電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；半干型轉膜儀（Typ-Nr.B337874，Biometra）；細胞超聲破碎儀（JY92-IIN，寧波新芝）；預染蛋白Maker（SM0441，Fermentas）；ECL 發光檢測試劑盒（P004，Vigorous）；丙烯酰胺（341，BioSHARP）；Protein A/G agarose beads（20421，Pierce）；PMSF（ST506，Beyotime）。

1.3 提取細胞總蛋白（1）收集細胞，加入細胞裂解液在冰上操作；（2）將冰盒放置于搖床30 min；（3）12 000×g，4℃離心20 min，留少量做Western blotting分析。

1.4 蛋白質免疫共沉淀實驗（1）PBS 清洗protein G瓊脂糖凝膠顆粒2次，RIPA（IP）緩沖液稀釋瓊脂糖凝膠至原濃度一半，吹打混勻；（2）取裂解液500 μL，加入1 μL正常與一抗同種屬的非免疫兔血清，再加入50 μL protein G 懸浮液；（3）4℃，孵育30 min，5 000 r/min 離心1 min；（4）預處理后裂解液體積約500 μL，按約0.2 mg裂解液總蛋白加2 μg抗體，4 ℃孵育過夜；（5）在裂解液—抗體孵育液中加入50 μL protein G 懸液；（6）4℃孵育2 h，5 000 r/min 離心1 min，上清，收集沉淀；（7）加入50 μL 甘氨酸溶液，輕柔混勻懸浮顆粒，5 000 r/min 離心1 min；加入5 μL Tris-HCl 溶液，再加蛋白酶抑制劑輕柔混勻；（8）SDS-PAGE及后續Western blotting（WB）。

1.5 Label-free 實驗（1）蛋白提取和還原烷基化處理：用預冷的PBS洗滌細胞，棄上清，加入蛋白裂解液，混勻后冰上孵育5 min；加l0 mmol/L 的DTT，冰浴超聲15 min；13 000×g，4 ℃離心20 min，將上清轉入新的離心管中；向離心管中加入4 倍體積預冷丙酮，-20 ℃過夜；離心收集沉淀，空氣中晾干；加入8 mol/L urea 溶液重新溶解蛋白；加入DTT 至終濃度10 mmol/L，56 ℃水浴30 min進行還原反應；加入IAM 至終濃度55 mmol/L，暗處室溫放置30 min進行烷基化反應；Bradford 法測定蛋白濃度。（2）酶解和除鹽：每個樣品取100 μg等量的蛋白質用于胰蛋白酶消化；酶解后C18柱脫鹽，干燥脫鹽后真空冷凍。（3）液相色譜—質譜聯用分析：質譜數據采集使用TripleTOF 5600+液質聯用系統（SCIEX）。

1.6 蛋白質組鑒定（1）數據庫選擇：NCBInr 全庫；（2）參數設置及鑒定結果用Protein Pilot 軟件分析質譜的結果，參數設置，見表1。

表1 Protein Pilot參數設置

1.7 生物信息學分析 通過蛋白質數據庫Uniprot的注釋信息，使用基因本體論（Gene Ontology，GO）對Huh7 細胞株中下拉的KTN1 結合蛋白進行注釋分析，初步了解他們在細胞中的作用；Huh7 細胞株中下拉的KTN1 結合蛋白信息與KEGG（https://www.kegg.jp）公共數據庫進行比對，對蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑進行注釋。通過整合來自GEO、TCGA、ArrayExpress 的全球肝細胞癌組織樣本基因芯片及mRNA測序數據，計算KTN1 結合蛋白的綜合表達水平及其與KTN1 的表達相關性。

2 結果

2.1 蛋白質提取效果鑒定及內源性KTN1的WB檢測 HepG2、Huh7、WRL68 等3 種細胞株的總蛋白條帶清晰可見，而且條帶的位置基本整齊一致，說明總蛋白的提取成功，可以進行后續的Western blotting和Co-IP實驗（圖1）。使用Hela細胞作為對照，結果可見4 種細胞在36 ku 大小位置有明顯的GAPDH的蛋白條帶，而且條帶灰度值基本一致（圖2）。

圖1 3種細胞總蛋白SDS-PAGE 電泳檢測

圖2 內源性KTN1的WB檢測

2.2 Co-IP 后Western blotting 及Co-IP 后蛋白銀染結果 用KTN1 抗體進行Co-IP 實驗下拉的蛋白中也可以檢測到KTN1 蛋白的條帶，位置亦于156 ku處。而陰性對照IgG 下拉的蛋白中，未見任何蛋白條帶（圖3）。在HepG2、Huh7、WRL68 等3 個細胞中，經過Co-IP富集均可見10個以上的條帶，而且條帶的位置基本與細胞總蛋白中的條帶相對應，陰性對照IgG的泳道則沒有蛋白條帶或者極少的蛋白條帶（圖4）。

圖3 WB檢測Co-IP蛋白中KTN1的含量

圖4 Co-IP后蛋白銀染結果

2.3 蛋白質組鑒定 3 種細胞中一共鑒定出29 種蛋白（表2），其中PRL、CASPE、ACTS、PRDX1 這4種蛋白僅在正常肝細胞株WRL68樣本中檢出，而H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3這8種蛋白僅Huh7樣本中檢出（圖5）。

圖5 3個細胞株KTN1相結合蛋白的韋恩圖

表2 蛋白質鑒定結果

2.4 蛋白質GO功能注釋 KTN1結合蛋白可以富集于14 個生物過程（圖6），其中cellular process、metabolic process、biological regulation、response to stimulus、multicellular organismal process、developmental process 等富集的蛋白數較多。這些蛋白還富集于11 個細胞組分，其中cell part、organelle、extracellular region part、organelle part有較多的蛋白富集。對于分子功能，這些蛋白一共富集于7 種分子功能，其中最多的是binding，一共富集了18種蛋白。

圖6 KTN1結合蛋白GO分析結果

2.5 蛋白質KEGG 通路注釋 富集了2 個以上蛋白的通路有14 個，其中富集基因數最多的Alcoholism和Systemic lupus erythematosus兩個通路均富集了5 個基因（圖7），分別是ACTN4、H4、H32、H2A1J、H2B1L和CALL5、H4、H32、H2A1J、H2B1L。

圖7 KTN1結合蛋白的Pathway通路富集

2.6 KTN1 結合蛋白表達驗證 如圖8 所示，與3135 例癌旁正常組織樣本相比，KTN1 結合蛋白H2B1L（由HIST2H2BE編碼）的mRNA水平在3532例肝細胞癌組織標本中顯著升高。KTN1 與HIST2H2BE表達水平存在明顯正相關。

圖8 KTN1結合蛋白的表達驗證

3 討論

KTN1可能通過其相結合的蛋白一起共同影響HCC的生物學過程。KTN1不僅可以與Rho家族成員的GTP 形式結合并相互作用，還可以與RhoA、Rac1 和Cdc42 的GDP 形式結合并相互作用，KTN1的肽片段可抑制吞噬體沿微管雙向運動。多項研究表明，KTN1 很可能成為Rho 家族的下游靶分子[9-10]。KTN1 可能通過調控CXCL8 基因的表達來促進三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）細胞生物學功能變化，并有望成為TNBC治療的潛在分子靶點[11]。敲低KTN1 會降低EGFR 蛋白的轉錄后表達，增加凋亡，抑制皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinomac，cSCC）細胞存活[12]。課題組前期也明確KTN1 在HCC 中高表達，且可以作為HCC 診斷和預后判斷的分子標記物。在HCC 細胞株Huh7 中敲除KTN1 基因后，Huh7 細胞株的生物學功能及表達譜發生了改變，差異基因參與多個癌癥相關通路[8]。目前尚缺乏KTN1 參與HCC的分子機制研究。從蛋白質GO功能注釋結果可以看到，這些結合蛋白主要的功能是binding并且參與了多種重要的生物學過程，如細胞過程、代謝過程、生物調節、刺激反應、多細胞生物過程、發育過程等。本研究發現H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3 等8 種蛋白僅在HCC細胞系Huh7樣本中檢出。H2B1L是核小體的核心成分，核小體將DNA 包裹并壓縮成染色質，通過阻礙反式作用因子與同源DNA序列的結合，在轉錄調控、DNA修復、DNA復制和染色體穩定中發揮核心作用[13]。IGHG2 為免疫球蛋白重鏈恒定區，具有抗原結合活性和免疫球蛋白受體結合活性，參與多個過程，包括激活免疫反應、對其他生物的防御反應和吞噬作用[14]。VSXL2是質膜的組成部分，具有細胞粘附分子結合活性并參與細胞與細胞之間的黏附。這些關鍵蛋白可能共同參與了KTN1 在HCC 中的生物學作用，其具體機制有待進一步研究。

本研究檢測獲得的KTN1結合蛋白雖然僅有29個，數目較少。但Pathway 通路富集顯示KTN1 相結合的蛋白參與了重要的通路。已有學者在系統性紅斑狼瘡（SLE）患者中發現抗KTN1 抗體，推測KTN1 參與了SLE 的進展[15]，這與我們富集到的結合蛋白所參與的通路一致。Alcoholism和Viral carcinogenesis也是兩個重要通路，研究表明，飲酒和乙型肝炎病毒感染均為HCC 患者的獨立危險因素[16-17]。KTN1 可能存在其它的蛋白亞型。從內源性及Co-IP 后KTN1 蛋白Western blotting 檢測結果可以看到，3 個細胞系無論是總蛋白還是Co-IP 后，都在130～140 ku 處均出現了兩個蛋白條帶。可以推測抗體結合到了蛋白家族的共有序列。這與公共數據庫UniProt 所提供的KTN1 3 個蛋白亞型數目和分子量都很接近（Q86UP2-2、Q86UP2-3、Q86UP2-4），說明Co-IP實驗結果準確性。

綜上所述，本研究通過Co-IP結合Label-free蛋白質組學技術在肝細胞癌株Huh7中鑒定出了20種KTN1蛋白結合蛋白，其中H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3 等8 種蛋白僅在HCC細胞系Huh7樣本中檢出，其中H2B1L、IGHG2、VSXL2 可能共同參與了KTN1 在HCC 中的生物學作用，具體機制有待進一步研究。