龍脷葉總黃酮干預對OVA誘導的哮喘大鼠肺內炎性浸潤、氧化應激的影響及機制探究*

何顯科，韋錦斌，陳偉杰

（1.欽州市第二人民醫院，欽州 535000；2.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021）

龍脷葉是大乾科、守宮木屬常綠小灌木，其葉可藥用，具有清肺止咳、化痰平喘的功效，常用于咳嗽、喉痛、急性支氣管炎等治療[1]。近年來，對龍脷葉的藥理研究報道較多，陳素雯等[2]研究顯示，龍脷葉水提取物可減輕哮喘大鼠肺組織與支氣管炎性病理改變，可能與降低炎性因子水平從而減輕炎癥反應有關。化學成分分析結果表明，龍脷葉中富含氨基酸、多糖、有機酸類、黃酮類等[3]，其中黃酮類化合物是龍脷葉的主要活性成分之一，挖掘相關藥用活性成分的功能途徑對于龍脷葉的藥理研究有重要意義。本研究采用卵蛋白（OVA）誘導的哮喘大鼠模型，觀察龍脷葉總黃酮干預對哮喘大鼠肺內炎性浸潤、氧化應激的影響，初步探討龍脷葉總黃酮的平喘機制，為今后開展深入此類研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：SPF 雄性SD 大鼠40 只，體重200～240 g，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2021-0002。龍脷葉總黃酮由課題組前期采用檸檬酸、纖維素酶、果膠酶浸泡龍脷葉酶解，再用混合菌種發酵后進行熱回流獲取，總黃酮含量80%以上。地塞米松片購自廣東南國藥業有限公司，國藥準字H44024618。主要試劑：OVA（美國Sigma），氫氧化鋁凝膠（大連美倫生物技術有限公司），活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）及內參β-actin 抗體（美國KPL），HRP標記的山羊抗兔二抗（美國Affinity）。

1.2 分組及給藥

40只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組、OVA 組、龍脷葉總黃酮低劑量組、龍脷葉總黃酮高劑量組及地塞米松組，每組8只。除正常組外，其他組大鼠采用OVA 誘導建立哮喘大鼠模型，第15 天至第26 天時給予12 d 的藥物干預，龍脷葉總黃酮低、高劑量組分別為腹腔注射20 mg/kg、50 mg/kg龍脷葉總黃酮，地塞米松組腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松，1次/d，正常組和OVA組以生理鹽水替代。

1.3 OVA誘導哮喘大鼠模型

除正常組外，其他組大鼠第1 天腹腔注射致敏液（50 μg OVA+1 mg 氫氧化鋁凝膠）0.2 mL/只，第14 天時再腹腔注射僅含50 μg OVA 致敏液0.2 mL/只，第27 天至第29 天以5%OVA 溶液霧化激發，每次激發20 min；正常組大鼠以PBS溶液替代[4]。

1.4 觀察指標

1.4.1 哮喘行為評分 末次激發開始10 min 內觀察大鼠哮喘行為并計分，其中無抓鼻或撓癢動作為0分，抓鼻或撓癢1～3次為1分，4～6次為2分，7次及以上為3 分；無哮喘癥狀為0 分，輕微哮喘癥狀為3分，呼吸急促、呼吸頻率加快或焦躁不安等癥狀為6分，嚴重呼吸困難為9分[5]。

1.4.2 BALF中細胞分類計數 激發結束后于大鼠氣管注入PBS 進入左肺，反復抽吸3 次回收BALF，1 500 r/min離心10 min，底部沉淀重懸于PBS溶液，涂片后晾干，采用迪夫快速染色，光鏡下觀察并計數嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及細胞總數。

1.4.3 肺組織病理組織學觀察 取大鼠左側肺組織固定于4%多聚甲醛溶液中過夜，經梯度酒精脫水，石蠟包埋制備厚度為4 μm 的組織切片，采用蘇木精－伊紅（HE）染色法，光鏡下觀察肺組織病理組織學變化。

1.4.4 血清和BALF中氧化/抗氧化因子水平檢測

末次激發24 h 內麻醉大鼠，腹主動脈取血3～5 mL，離心分離血清，-80 ℃冰箱保存。參照試劑盒說明書，檢測血清和BALF中ROS和SOD水平。

1.4.5 Western blotting 檢測肺組織 中PI3K/AKT 通路蛋白的表達 取大鼠右側肺組織充分裂解后，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度再進行水浴變性，取50 μg 樣品上樣于10%PAGE-SDS，待溴酚藍跑至距凝膠底部1 cm 處停止電泳，采用濕轉法恒流電轉，取出PVDF 膜浸泡于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBS 洗膜2 min×1 次，孵育兔抗PI3K、AKT、p-AKT及β-actin抗體（1∶1 000）4 ℃下搖床過夜，TBST 洗膜8 min×5 次，孵育HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫搖床1 h，TBST洗膜8 min×5 次，進行化學發光顯影，經Image J 軟件檢測蛋白條帶灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件分析處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠哮喘行為評分的比較

與正常組比較，末次激化10 min內OVA組大鼠哮喘行為評分升高（P＜0.05）；與OVA組比較，龍脷葉總黃酮低、高劑量組及地塞米松組哮喘行為評分降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠哮喘行為評分的比較（n=8）

2.2 各組大鼠BALF中細胞分類計數的比較

與正常組比較，OVA 組大鼠BALF 中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及細胞總數升高（P＜0.05）；與OVA 組比較，龍脷葉總黃酮低、高劑量組及地塞米松組BALF 中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及細胞總數降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠BALF中細胞分類計數的比較

2.3 各組大鼠肺組織病理組織學變化的比較

正常組大鼠肺組織支氣管管壁正常，黏膜上皮完整，平滑肌層細胞排列有序，均未見明顯的變性與壞死。OVA組大鼠肺組織支氣管管壁增厚，黏膜上皮變性，平滑肌層增厚明顯，且細胞排列無序，并伴有大量炎性細胞浸潤；龍脷葉總黃酮低、高劑量組及地塞米松組上述肺組織病理損傷較OVA 組明顯減輕，見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織病理組織學變化的比較（HE×200）

2.4 各組大鼠血清和BALF 中氧化/抗氧化因子水平的比較

與正常組比較，OVA 組大鼠血清和BALF 中ROS水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；與OVA組比較，龍脷葉總黃酮低、高劑量組及地塞米松組血清和BALF 中ROS 水平降低，SOD 水平升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠血清和BALF中氧化/抗氧化因子水平的比較

2.5 各組大鼠肺組織中PI3K/AKT通路表達的比較

與正常組比較，OVA 組大鼠肺組織中p-AKT/AKT 和PI3K 表達升高（P＜0.05）；與OVA 組比較，龍脷葉總黃酮低、高劑量組及地塞米松組p-AKT/AKT和PI3K表達降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織中PI3K/AKT通路表達的比較

3 討論

龍脷葉廣泛分布于我國福建、廣東、廣西等南方地區，具有重要的藥用價值，現代藥理學研究結果顯示，龍脷葉具有多種生物學功能，包括抗炎鎮痛、抗氧化等[6]。黃酮類化合物作為龍脷葉的有效活性成分之一，不僅參與植物的生長發育，還具有很廣泛的藥用功效[7]，但關于龍脷葉總黃酮的藥理研究較少。哮喘是常見的肺部疾病，其主要特征為可逆性氣道阻塞，可由起到平滑肌痙攣、氣道黏膜水腫、黏液分泌增加等多種因素導致[8]。目前，哮喘的具體病因和機制尚未完全闡明，多與遺傳、變應原、空氣污染、呼吸道病毒感染等有關[9]。龍脷葉用于哮喘治療由來已久，本研究通過分析龍脷葉總黃酮對哮喘大鼠的影響，初步闡明其發揮平喘作用的潛在機制。

以OVA誘導哮喘大鼠模型是常見的建模手段，觀察龍脷葉總黃酮對哮喘的抑制作用，結果顯示，龍脷葉總黃酮可明顯緩解模型大鼠哮喘行為。眾所周知，哮喘是由嗜酸性粒細胞、T 淋巴細胞、巨噬細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥，BALF 中炎性細胞數量可直接反映哮喘的病情程度[10]。龍脷葉總黃酮干預后，哮喘大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及細胞總數明顯降低，這對于減輕哮喘癥狀加重有重要作用。同時，肺組織病理染色觀察發現，龍脷葉總黃酮可顯著減輕大鼠肺組織病理損傷，包括緩解支氣管管壁和平滑肌層增厚，減少黏膜上皮變性和炎性細胞浸潤。上述結果表明，龍脷葉總黃酮可明顯降低哮喘模型大鼠哮喘行為評分，減少肺內炎性細胞浸潤，從而改善OVA誘導的肺組織炎性病理改變。

氧化應激也參與哮喘的發病進程，環境刺激或機體自身原因引起ROS合成增加、ROS清除能力下降及體內抗氧化能力降低，導致體內產生一系列應激反應，加重哮喘[11]。其中ROS不僅可增加起到反應性，還可引起肺泡上皮細胞損傷，并間接性參與氣道炎癥過程，促進哮喘的發生與發展[12]。SOD 作為體內重要的抗氧化酶，是清除氧自由基的關鍵物質[13]。因此，糾正氧化—抗氧化平衡失調，也是哮喘治療的有效切入點。本研究結果顯示，與OVA組比較，龍脷葉總黃酮低、高劑量組大鼠血清和BALF中ROS水平明顯降低，SOD水平明顯升高（P＜0.05），說明龍脷葉總黃酮具有調控哮喘大鼠氧化應激反應的作用。

PI3K/AKT 信號通路在多種生理學過程中廣泛存在，如細胞生長、增殖、凋亡和炎性介質形成等[14]。基礎研究表明，阻斷PI3K/AKT 信號通路的活化，可降低炎性細胞因子的滲出，緩解氣道高反應性，在哮喘動物模型中發揮防治作用[15-17]。本研究結果顯示，龍脷葉總黃酮處理后，哮喘大鼠肺組織中p-AKT/AKT和PI3K表達明顯降低（P＜0.05），說明龍脷葉總黃酮可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化，改善哮喘的炎癥反應。

綜上所述，龍脷葉總黃酮可減輕OVA誘導的哮喘大鼠癥狀，減少肺內炎性細胞浸潤，緩解氧化應激水平，可能與抑制PI3K/AKT 通路的激活有關。本研究探究龍脷葉總黃酮治療哮喘的初步機制，這將有助于全面深入研究龍脷葉的藥理作用，更好的服務于臨床，后續將在此基礎上深入龍脷葉總黃酮的相關機制研究。