DLC1缺失可通過減少腫瘤免疫促進膀胱上皮細胞癌進展

楊博，楊中華，張奇峰，張瀚，韋羽，王勝

（1.桂林市人民醫院泌尿外科，廣西 桂林 541002；2.桂林市人民醫院麻醉科手術室，廣西 桂林 541002）

0 引言

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，研究表明美國每年約有84000個新發病例和17,000人死亡[1]。2020年世界衛生組織報告顯示全球膀胱癌每年新增約60萬病例和21萬死亡病例，在新發病率總人數中排名第11位，每年癌癥死亡率方面排名第14位[2]。此外調查顯示2020年膀胱癌在中國男性新發病例數中排名第七位（66242），占總新發癌癥病例的2.7%[3]。膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, MIBUC）是膀胱癌中發病率最高的一種，雖然近年來新的靶向治療方法提高了MIBUC患者的生存率，但患者的預后仍不盡如人意，5年生存率仍低于22.07/100000[2]。目前MIBUC發病機制并不明確，因此進一步研究不同分期腫（特別是早期）瘤組織中相關基因或蛋白的變化，有助于進一步明確MIBUC的發病機制可能為早期診斷和治療提供新的思路。

RHO家族的RAS相關GTP酶（包括CDC42、RAC和RHO）可調節各種細胞增殖、細胞骨架和粘附功能[4-5]，多項研究表明RHO活性在多種晚期腫瘤中增加[6]。盡管RAS-GTP酶在腫瘤中經常因突變而被激活[7-8]，但這種變化在RHO家族GTP酶中卻不太常見[9-10]。相反，其激活劑--RHO特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）功能的增加，和/或其失活劑--Rho鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑（GDIs）和RHO特異性GTP酶加速蛋白（GAPs）功能的降低可維持RHO家族GTP酶活性[5,11,12]。研究發現GAPs將活性Rho-GTP的γ磷酸酯水解為非活性Rho-GDP[10]。人類基因組中的69個RHO特異性GEFs中，只有少數幾個與腫瘤的發生有關。然而，在64個RHO特異性GAPs中，肝癌刪除（Deleted in Liver Cancer, DLC）家族的Rho-GAPs成員在癌癥中表達減少[13-14]。這個家族由三個密切相關的基因組成。DLC1（也被稱為Rho GTPase-activating protein 7, ARHGAP7），DLC2，和DLC3。它們編碼的Rho-GAP活性強烈地水解Rho-GTP, 進而導致RAS相關GTP酶失活[15]。一個或多個DLC基因的下調可能與肝癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌和乳腺癌相關[16-17]。DLC1是最先發現的Rho-GAPs成員，多項臨床和實驗研究表明其是一個真正的腫瘤抑制基因。DLC1過量表達可顯著抑制腫瘤生長[17]，而內源性DLC1的失活與其他基因和/或表觀遺傳學變化一起，可導致細胞轉化和腫瘤形成[18]。然而，DLC1在腫瘤進展和腫瘤免疫學中的潛在功能和機制仍不清楚，且目前DLC1在MIBUC中的表達及臨床意義尚未見報道。因此進一步探究DLC1在MIBUC的發病機制，可能為今后臨床診斷及治療提供新思路。

在這項研究中，我們旨在利用TCGA RNA測序數據，并結合生物信息學和統計方法，包括差異表達基因(DEG)分析、基因本體(GO)術語分析、KEGG通路或疾病分析、基因集富集分析（GSEA），以及Logistic & Cox回歸分析系統地分析DLC1在MIBUC中的重要性。

1 方法和材料

1.1 數據來源與處理

NCBI網 站Gene Expression Omnibus （GEO）數據庫下載數據集GSE52519相關資料，其中包含3例正常膀胱組織及9例膀胱癌組織的RNA測序數據。使用R語言impute和limma包分別進行標準化處理及基因差異性分析。

基因表達數據與臨床信息來自TCGA-BLCA項目（癌旁19，膀胱上皮癌414例，數據庫：The Cancer Genome Atlas（TCGA），平臺：RNASeq，格式：TPM）。通過R語言limma包提取MIBUC表達數據。

1.2 差異行基因分析

GSE52519 RNA數據進行差異性分析后，選取調整后P值（adjusted P value）＜0.05及 Log2 fold change (Log2FC)＞1.5的基因定義為差異性基因。利用ggplot2和ComplexHeatmap包進行火山圖和熱圖分析。

1.3 DLC1在TCGA-BLCA項目中的表達

非配對樣本使用R語言ggplot2進行正態性分布檢驗及Mann-Whitney U檢驗(Wilcoxon rank sum test)，并繪制DLC1表達箱圖。配對樣本使用ggplot2進行正態性分布檢驗后，選擇配對樣本T檢驗進行統計分析，并繪制DLC1配對表達差異圖。

1.4 免疫細胞浸潤的功能富集和分析

GSEA從DLC1差異表達矩陣入手并分析DLC1高表達組和低表達組之間信號通路的差異，以預測與DSEA相關的表型和信號通路。調整后的P＜0.05和FDR＜0.25被確定為顯著的相關通路。使用R軟件包clusterProfiler（3.8.0）進行統計分析和繪圖。

通過ssGSEA對24種免疫細胞的相對腫瘤浸潤水平進行量化，檢測各種免疫細胞標志性基因的表達水平[19]。為了進一步探討DLC1與免疫細胞浸潤水平之間的相關性，以及免疫細胞浸潤與DLC1不同表達組之間的關系，我們采用了Wilcoxon秩和檢驗和Spearman相關性分析。

1.5 臨床病理特征相關性分析

所有的統計分析都在R包（V3.6.2）中進行。臨床病理特征和DLC1之間的關系用Wilcoxon符號秩和檢驗和邏輯回歸進行分析。多變量Cox分析比較了DLC1表達對生存的影響，以及其他臨床特征（分期、淋巴結狀態、遠處轉移狀態、年齡等）。DLC1表達的臨界值是是由其中位數決定的。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

1.6 MIBUC中DLC1低表達組和高表達組差異性基因分析

使用DESeq2（1.26.0版本）對DLC1低表達組（0-50 %）和高表達組（50%-100%）進行差異性基因分析。調整后的基因P值小于0.05且絕對FC值大于1.5的基因被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DLC1在MIBUC中低表達

為探索膀胱尿路上皮癌的潛在機制，我們使用已發表的數據集（GSE52519）分析3例正常膀胱組織和9例膀胱癌組織差異性表達基因（DEGs）。結果顯示滿足adjusted P value＜0.05且 Log2FC＞1.0 共有25個基因(圖1A)，15個顯著差異性基因(adjusted P value＜0.05及 Log2FC＞1.5)，其中上調的基因1個，下調基因14個（圖1B）。為更好地了解DEGs和膀胱瘤尿路上皮癌之間的關系，我們進一步分析TCGA數據庫中的TCGA-BLCA項目（癌旁19列，膀胱上皮癌414例），并分別比較了GSE52519前10個差異性基因在TCGA-BLCA項目中的表達情況（圖1C）。與GSE52519變化一致的是DLC1, PRAC1, PLPPR4, ANKDD1A在腫瘤組織中顯著下調。鑒于DLC1Log2FC絕對均大于上述其他3個差異性基因，我們選擇DLC1做為靶基因以進一步研究，其與MIBUC之間的關系。

接著我們進一步分析DLC1在TCGABLCA項 目 中 非 配 對 樣 本（癌 旁：3.92±0.97，腫 瘤：2.45±0.97，P=0.007）及 配 對 樣 本（t=-4.990,P＜0.001）中的表達情況，結果顯示腫瘤組織DLC1表達均顯著低于癌旁組織（圖1D, 1E）。據此我們想了解DLC1下調是否可以作為MIBUC的一個指標。進一步行診斷性研究中的ROC曲線分析發現DLC1（癌旁 vs 腫瘤，曲線下面積：0.865，置信區間：0.776-0.954）(圖1F)，該結果表明DLC1下調可作為診斷MIBUC的參考指標。

圖1 DLC1表達情況分析(A) GSEA52519基因火山圖分析。 (B) GSEA52519中15個顯著性差異性基因熱圖。（C）GSEA52519前10個顯著差異性基因表達情況。（D-E）TCGA-BLCA項目中DLC1差異性表達情況，（D）非配對樣本，（E）配對樣本。（F）診斷性研究中的ROC曲線分析

2.2 DLC1基因表達與MIBUC患者臨床病理特征相關性分析

為進一步探究DLC1與MIBUC患者臨床病理特征間得關系，我們分別對TCGA-BLCA數據中MIBUC患者進行分別進行T、N、M臨床分期分析，結果表明正常組織與T1分期中DLC1的表達并無明顯差異，但T2、T3、T4期DLC1出現顯著下降（圖2A）。同樣我們觀察到N0、N1、N2及N3腫瘤組織中DLC1表達較對照組下調（圖2B），M0、M1中DLC1表達也明顯低于對照組（圖2C）。另外我們還注意到Ⅰ期腫瘤組織DLC1下降不顯著，但DLC1的表達明顯高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，然而當DLC1下降到一定程度后它的表達并不隨著腫瘤分期的增加而改變（圖2D）。有趣的是DLC1在中瘤組織中顯著下調，且與吸煙、性別、年齡、治療無關（圖2E-H）。為探究DLC1的表達情況是否會影響MIBUC患者生存時間，我們將患者分為高表達DLC1組和低表達DLC1組（表1），并對著兩組患者進行生存分析。研究發現總生存期（Overall survival，OS）在DLC1高表達患者和低表達患者中差異有統計學意義（圖2I）。

表1 DLC1的表達與臨床病理特征相關（邏輯回歸）

圖2 DLC1表達和臨床病理特征的關系，包括（A）T分期，（B）N分期，（C）M分期，（D）病理階段，（E）性別，（F）年齡，（G）治療，（H）吸煙，（I）生存曲線分析（總生存期 OS）。

2.3 DLC1在可能參與MIBUC的發生發展

既往研究發現，DLC1在肝癌、肺癌中表達下調，因此我們猜測DLC1表達下調可能與腫瘤有關。為證實該猜想，我們進一步分析了DLC1在泛癌中的表達情況。與我們猜測一致的是DLC1在絕大多數腫瘤中低表達（圖3A）。接著我們進一步將TCGA-BLCA項目中MIBUC患者分為DLC1高表達組和低表達組并行基因差異性分析。結果顯示共有910個差異性基因，我們進一步行GSEA分析發現差異性基因在腫瘤相關通路路上顯著富集（NSE＞1.5,False discovery rate (FDR)＜0.25且p.adjust＜0.05）（圖3B-E）。另外我們還發現凋亡相關也被顯著富集。既往研究表明凋亡減少可導致中瘤細胞增殖，是腫瘤發生發展的重要機制[20]。據此我們近一步猜測DLC1的下調參與MIBUC發病的病理分子機制。

圖3 DLC1高表達組與低表達組差異性基因GSEA富集分析。（A）DLC1基因在多種腫瘤中下調。DLC1高表達組與低表達組差異性基因GSEA富集分析，（B-F）差異性基因在腫瘤相關通路顯著富集。

2.4 下調DLC1可能減少MIBUC腫瘤組織免疫浸潤

最后我們想進一步了解DLC1下調引起腫瘤的發病的可能機制。因此，我們對DLC1高表達組和地表達組間差異性基因進行GO和功能富集分析發現免疫相關通路被顯著富集。進一步在TCGA-BLCA項目中分析DLC1與免疫細胞浸潤情況，我們發現DLC1與腫瘤組織中多種細胞免疫浸潤有關（圖4A-B），其中T淋巴細胞、B淋巴細胞、CD8T淋巴細胞、DC細胞、巨噬細胞、NK細胞、T輔助細胞、Th1、Th17細胞在DLC1高表達組顯著富集（圖4C），且DLC1分別予T淋巴細胞、B淋巴細胞、DC細胞、NK細胞、中性粒細胞、巨噬細胞呈正相關關系（圖4D-I）。考慮到DLC1與上述免疫細胞有關，而MIBUC患者腫瘤組織中DLC1顯著下調。據此，我們猜測MIBUC發病可能與中瘤細胞DLC1下調后導致免疫細胞浸潤減少有關。

圖4 DLG1的表達水平與腫瘤微環境中的免疫浸潤有關。（A）DLC1相關差異性基因在免疫相關通路富集。（B）24種免疫細胞的相對豐度與DLC1表達水平之間的相關性。（C-I）箱線圖和相關性圖顯示DLC1高組和低組之間T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和Th17細胞浸潤水平的差異。

3 討論

目前DLC1在MIBUC中的表達情況及對MIBUC的影響尚未見相關報道。同時考慮到DLC1在多項腫瘤組織中表達下調，可能與腫瘤的發病有關[16]，在這項研究中我們將分析DLC1在MIBUC中的作用。我們通過對GEO數據庫及TCGA數據庫相關RNA測序數據發現DLC1下調可能是MIBUC的一個重要的發病機制及診斷指標。

DLC1在抑制實體瘤發展方面起著不可或缺的作用[21]。DLC1可通過抑制Rho信號通路抑制腫瘤細胞遷移及侵襲[22]當DLC1下調可導致DLC1-RhoARock1信號激活進而促進腫瘤細胞遷移及侵襲[22-23]。在該項目中，無論是GSE52519數據集，還是TCGABLCA項目，DLC1在MIBUC腫瘤組織的表達均顯著低于癌旁組織，且TCGA-BLCA項目中DLC1高表達組與低表達組間的差異性基因在腫瘤相關的通路中顯著富集。上述結果表明DLC1表達下調可能通過PD1信號通路、EGFR信號通路、CTLA4信號通路及PI3K等腫瘤相關信號通路促進MIBUC發病。

另外多項研究表明DLC1具有促進細胞凋亡[24]，抑制腫瘤細胞增殖的作用[25]。沉默DLC1可抑制膽囊癌細胞凋亡，然而在過表達DLC1的膽囊癌細胞中DLC1可通過促進線粒體向細胞質釋放細胞色素C，激活的凋亡信號通路，促進Bax和裂解的caspase-3/8/9的表達，并抑制Bcl-2[24]。另外在肝細胞肝癌HCC細胞系中，過表達DLC1導致RhoA水平明顯下降，最終誘導HCC凋亡增加[26]。同樣在該項研究中我們發現抑制凋亡相關蛋白在DLC1低表達組顯著富集，提示MIBUC發病可能與DLC1下調導致的促凋亡功能障礙有關。

最后，我們的研究發現DLC1可能具有免疫促進的作用，雖然目前尚未見相關文章報道DLC1與腫瘤免疫之間的關系。但在本研究中，我們發現DLC1與多種免疫細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、中性粒細胞、DC細胞等成正相關關系。據此我們推測DLC1可能通過促進多種淋巴細胞浸潤，抑制腫瘤形成。而DLC1表達將低，可導致異型（異常）細胞清除減少，最終導致中瘤細胞形成及增殖。因此關于DLC1促進腫瘤免疫的研究需進一步實驗及臨床證實。

這項研究中，我們發現DLC1在MIBUC腫瘤組織中顯著下調，它可能通過促進腫瘤細胞增殖、遷移，抑制細胞凋亡促進腫瘤的發生發展，同時中瘤組織中下調的DLC1無法促進免疫細胞向腫瘤組織浸潤，進而導致腫瘤免疫抑制，進一步促進腫瘤發生發展。據此我們可以認為DLC1具有腫瘤抑制作用，盡管具體的機制需要通過實驗深入研究。