復發(fā)性流產(chǎn)患者淋巴細胞主動免疫的治療效果及其與HLA抗體的相關性研究

陳晨，文志發(fā)，劉佳

（南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004）

0 引言

依據(jù)世界衛(wèi)生組織指南，反復性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的定義為和同一配偶發(fā)生連續(xù)三次及以上且妊娠小于28周的自然妊娠失敗，是一種比較常見的妊娠并發(fā)癥，引起RSA的病因復雜且無典型的臨床表現(xiàn)，其中能找到明確病因的僅占50%，另一部分無明確病因的稱為原因不明反復自然流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）[1]。RSA的病因多樣，主要包括母體生殖道解剖異常，內分泌紊亂，夫妻染色體異常，生殖系統(tǒng)感染，宮頸機能不全，免疫功能異常及血栓形成傾向，其中大部分與免疫紊亂有關[2]。而免疫性流產(chǎn)又可以分為自身免疫型和同種免疫型，其中同種免疫型流產(chǎn)的發(fā)生則與人類白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）免疫應答密切相關[3]，臨床上往往表現(xiàn)為患者血清的HLA抗體檢測結果呈陰性。目前，隨著醫(yī)療水平不斷進步，淋巴細胞主動免疫治療（lymphocyte active immunotherapy, LAI）已經(jīng)作為專門用于RSA患者中以HLA抗體缺乏為特征的重要臨床診療措施[4-5]。根據(jù)近年臨床案例的回顧性分析，淋巴細胞主動免疫治療可顯著提高該類RSA患者最終妊娠的成功率，同時母子的安全性良好[6-7]。本院與南京市紅十字血液中心合作，血液供應者以無償獻血的方式一次性獻全血400mL，選取全血經(jīng)成分分離后的白膜用于淋巴細胞的提取，然后用自體血漿深低溫凍存，使用時分次復蘇后供RSA患者用于免疫治療。本研究統(tǒng)計分析淋巴細胞主動免疫治療前后患者體內抗HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ抗體的變化情況及治療效果，并初步探討其間的關系。

1 材料和方法

1.1 對象

選擇2019年10月至2020年10月由本院中醫(yī)科門診確診的82例RSA患者，連續(xù)自然流產(chǎn)≥3次，血常規(guī)、肝腎功能及凝血功能均正常，抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白抗體、抗子宮內膜抗體檢測結果均為陰性，無傳染病性疾病，HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體為陰性，并且排除染色體異常、子宮解剖結構異常、內分泌異常、自身免疫性疾病。

1.2 試劑

HLA特異性抗體檢測試劑盒（美國萊姆德公司）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細胞制備

首先確定丈夫無傳染性疾病（乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒），然后獻全血400mL，通過成分分離形成白膜，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法獲得淋巴細胞，由90%自體血漿+10%二甲基亞砜重懸，調節(jié)淋巴細胞濃度至（2-4）×107個/mL，程序降溫置于液氮中凍存，復蘇方可后使用。

1.3.2 免疫方法

復蘇后的淋巴細胞給予患者前臂內側多點皮下注射。

1.3.3 治療方案

皮下注射淋巴細胞4次為一個療程，每次注射間隔時間為2周，一個療程后復查患者體內的HLA抗體，若結果轉為陽性，可考慮備孕，孕后再加強注射3~4次，每次間隔3~4周，直至孕12周。若轉陽備孕后未能妊娠，每隔6~8周加強注射1次。若HLA抗體檢測結果未轉陽，需繼續(xù)進行一療程免疫治療后再考慮妊娠。

1.3.4 HLA抗體檢測

研究對象均于早上抽取空腹靜脈血3mL，靜置30min后以3500轉每分鐘離心15min，然后分離血清于凍存管，置于-20℃冰箱保存，測定前血清經(jīng)解凍并平衡至室溫。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測患者血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗體，嚴格按照HLA特異性抗體檢測試劑盒（美國萊姆德公司）說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 HLA抗體轉陽率比較

患者第一療程結束7天后抽血，檢測其血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體，計算第一療程HLA抗體的轉陽率。第一療程未轉陽患者，繼續(xù)予以第二療程然后再次檢測，計算第二療程HLA抗體轉陽率和累計轉陽率。

1.4.2 妊娠成功率比較

妊娠成功的判斷標準為至少需滿足妊娠≥14周且B超檢查未見異常。隨訪RSA患者，統(tǒng)計各組妊娠成功率，以其作為療效評價的依據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HLA抗體轉陽率統(tǒng)計

82例RSA患者依據(jù)上述治療方案進行免疫治療，第一療程結束后有54例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉陽，第一療程的轉陽率為65.9%；第二療程結束后又有19例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉陽，累計轉陽率為89%。

2.2 淋巴細胞主動免疫治療后HLA抗體陽性與陰性者再次妊娠成功率統(tǒng)計

82例接受治療患者中，治療前82例HLA抗體均為陰性，治療后73例產(chǎn)生HLA抗體（累計轉陽率89%），其中再次妊娠成功66例，成功率90.4%；未產(chǎn)生HLA抗體的9例中，成功1例，成功率11.1%，HLA抗體陽性者再次妊娠成功率顯著高于陰性者，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 82例RSA患者淋巴細胞主動免疫治療后HLA抗體轉陽率統(tǒng)計(n,%)

表2 82名RSA患者淋巴細胞主動免疫治療后HLA抗體陽性與陰性者妊娠成功率統(tǒng)計

3 討論

RSA的發(fā)生在育齡女性中并不罕見，同時其再次流產(chǎn)的風險伴隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而不斷升高，據(jù)相關文獻報道，RSA患者再次流產(chǎn)的概率可高達75%[8]。隨著我國生殖免疫學不斷進步，不少學者逐步認識到RSA的發(fā)生與發(fā)展和患者的免疫功能異常息息相關[9]。近年來，也出現(xiàn)由于抗核抗體導致RSA的幾種假說：（1）抗核抗體的抗原具有RNA多聚酶的作用，產(chǎn)生的相關抗體引起RNA轉錄障礙，使得DNA無法復制，從而導致流產(chǎn)的發(fā)生。（2）由于外界因素侵犯了自身的免疫屏障，促進淋巴細胞活化，而活化生成的淋巴細胞中的染色質是引起抗核抗體產(chǎn)生的重要抗原，累積的免疫原不斷刺激免疫系統(tǒng)，從而導致RSA的發(fā)生與發(fā)展。（3）抗核抗體可能干擾了胚胎細胞復制分裂的過程，從而引起流產(chǎn)[10]。（4）抗核抗體參與形成的免疫復合物沉著于蛻膜血管組織的表面，影響胎盤的正常發(fā)育，因而引發(fā)流產(chǎn)[11]。（5）還有少數(shù)觀點認為抗核抗體可能會阻礙子宮內膜的發(fā)育，影響胚胎著床和生長，最終導致流產(chǎn)[12]。

從生殖免疫學角度分析，妊娠可設想為是一種半同種移植的過程，而流產(chǎn)則可視為半同種移植的失敗[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于RSA患者人類白細胞抗原（HLA）相容性增強，HLA抗體呈陰性，母體對胚胎父系同種抗原呈低識別或者低反應狀態(tài)，以致不能夠產(chǎn)生足量的保護性抗體，胚胎就會遭受母體免疫系統(tǒng)的攻擊反應，最終導致流產(chǎn)[14-15]。

針對RSA患者的淋巴細胞主動免疫療法，經(jīng)過幾十年的臨床驗證，幫助大部分RSA患者妊娠成功并分娩，其治療效果有目共睹。主動免疫治療是用他人富含人類白細胞抗原的淋巴細胞對患者進行多次皮下注射，有效刺激機體產(chǎn)生HLA抗體，誘導機體對胚胎產(chǎn)生免疫耐受。但同時大量臨床案例也表明RSA患者是否能夠產(chǎn)生HLA抗體與其接觸抗原量、免疫反應次數(shù)等因素有關。大量研究表明主動免疫治療后產(chǎn)生的HLA抗體與再次妊娠的成功率呈正相關，因此主動免疫治療后對HLA抗體的監(jiān)測尤為重要[16]。

本研究中82例RSA患者免疫治療前HLA-Ⅰ、Ⅱ抗體檢測結果均為陰性，在接受淋巴細胞主動免疫治療兩個療程后，73例HLA抗體轉陽，HLA抗體轉陽后再次妊娠的成功率高達90.4%，而HLA抗體仍為陰性的妊娠成功率僅為11.1%。由此可證明淋巴細胞主動免疫治療能有效促使RSA患者HLA抗體轉陽，并可提高妊娠成功率。然而本次研究也發(fā)現(xiàn)妊娠成功者中仍有1例HLA-Ⅰ、Ⅱ抗體均為陰性，妊娠失敗者中也有7例HLA抗體已轉陽，分析原因，一方面可能是由于免疫反應具有個體差異；另一方面也說明RSA的病因復雜多樣，至今尚未完全明了。

據(jù)統(tǒng)計，經(jīng)淋巴細胞主動免疫治療分娩的嬰兒各項指標均正常，成功率可達70%以上[17]，證實淋巴細胞主動免疫療法的確對RSA患者治療效果良好，而HLA抗體與復發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）治療效果也密切相關，可作為重要的臨床監(jiān)測指標。隨著生殖免疫學領域的發(fā)展，RSA的發(fā)病機理及淋巴細胞主動免疫的治療機制將得到進一步的闡明。