BCP 區和前C 區突變檢測在慢加急性肝衰竭中的臨床價值

王倩倩 胡耀仁 高國生,3

1.寧波大學醫學院附屬醫院檢驗科，浙江寧波 315020；2.中國科學院大學寧波華美醫院肝病科，浙江寧波 315010；3.浙江省消化系統腫瘤診治及研究重點實驗室，浙江寧波 315010

慢加急性肝衰竭（acute–on–chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝臟疾病基礎上經急性誘因刺激導致的大量肝細胞壞死的肝衰竭綜合征，臨床表現為急性黃疸加深、凝血功能重度障礙等。ACLF 的誘因眾多，主要包括嗜肝病毒感染、藥物和肝毒性物質（如酒精、化學制劑等）攝入等；我國為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的高流行區域，因此HBV 相關ACLF 占比高達90%以上。慢性HBV 感染相關疾病重癥化的發病機制復雜，與免疫損傷、內毒素血癥、微循環障礙等均有關聯，系病毒和宿主兩方面共同作用的結果，其中HBV 基因突變導致的病毒生物學特性改變及免疫耐受失衡是重要的影響因素。本文基于基因芯片技術對慢性乙型肝炎（chronic hepititis B，CHB）和HBV 相關ACLF 患者基本核心啟動子區（basic core promoter，BCP）A1762T/G1764A、前C 區G1896A 突變情況進行檢測，以期為闡明HBV 相關ACLF 發病機制提供循證醫學依據，并為臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2010 年9 月至2020 年10 月在中國科學院大學寧波華美醫院肝病中心就診的403 例慢性HBV感染患者，其中男349 例，女54 例，年齡36.00（30.00～42.00）歲。根據是否發生ACLF 將其分為CHB 組（369 例）和ACLF 組（34 例）；ACLF 組患者病情好轉出院或3 個月內病情穩定者歸為緩解組，病情惡化、放棄治療自動出院、死亡者歸為惡化組。納入標準：①慢性HBV 感染診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》，臨床表現為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區疼痛等；ACLF 診斷符合《肝衰竭診療指南（2018 年版）》，臨床表現為迅速加深的黃疸、嚴重凝血功能障礙和程度不等的肝衰竭。排除標準：①合并其他肝炎病毒感染；②合并惡性腫瘤；③合并酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病；④妊娠期女性；⑤關鍵實驗室數據缺失。本研究經中國科學院大學寧波華美醫院醫學倫理委員會批準同意（批件號：PJ–NBEY–KY–2017–070–01），所有患者均簽署書面告知同意書。

1.2 檢測方法

所有患者均于入院時檢測肝功能、乙肝三系定量、HBV–DNA 和A1762T/G1764A、G1896A 突變，261 例患者檢測了凝血酶原時間（prothrombin time，PT）。乙肝三系定量檢測采用美國 Abbott 公司ARCHITECT i2000SR化學發光免疫分析儀及配套試劑盒；HBV–DNA 檢測采用美國Applied Biosystems公司ABI 7500型熒光定量PCR儀和中山大學達安基因股份有限公司提供的試劑盒；A1762T/G1764A、G1896A 突變檢測采用基因芯片法，相關技術由寧波瑞芯生物科技有限公司提供，操作步驟見課題組前期文獻。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0 軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料經Shapiro–Wilk 檢驗均為非正態分布，采用中位數（四分位數間距）即（Q，Q）表示，兩組間比較采用Mann–Whitney檢驗；計數資料用例數（百分率）[（%）]表示，比較采用χ檢驗；采用多因素Logistic 回歸分析篩選發生ACLF的獨立影響因素，并構建聯合預測模型。同時繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線），以曲線下面積（area under curve，AUC）評價模型的診斷價值。<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB 組和ACLF 組患者的臨床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突變情況

ACLF 組患者的年齡、總膽紅素（total bilirubin，TBiL）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）均顯著高于 CHB 組（<0.05），乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性率、白蛋白（albumin，ALB）均顯著低于CHB 組（<0.05）。兩組患者A1762T/G1764A突變率比較差異無統計學意義（>0.05），ACLF 組患者G1896A 突變率顯著高于CHB 患者（<0.05），見表1。

2.2 影響ACLF 發生的多因素Logistic 回歸分析

對表1 中存在差異的指標進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示年齡、TBiL、ALB、G1896A 突變均是發生ACLF 的獨立影響因素（<0.05），見表2。基于上述4 項指標建立聯合預測模型，其診斷ACLF的AUC 為0.950（<0.001），敏感度和特異性分別為88.24%和93.22%，見圖1。

圖1 聯合預測模型診斷ACLF 的ROC 曲線

表1 CHB 組和ACLF 組患者的臨床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突變情況比較

表2 影響ACLF 發生的多因素Logistic 回歸分析

2.3 緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A突變率比較

緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A突變率比較差異均無統計學意義（>0.05），見表3。

表3 緩解組和惡化組患者的A1762T/G1764A、G1896A 突變率比較[n（%）]

3 討論

患者感染HBV 后的臨床結局受病毒、肝細胞及宿主免疫反應等多方面影響。由于HBV 的復制要經過前基因組RNA 的反轉錄過程，而反轉錄酶缺乏穩定的校對功能，在環境壓力及藥物誘導等作用下，發生突變的頻率較高。HBV 變異可打破機體內已經建立的固有免疫平衡，通過改變病毒的生物學特性誘導肝細胞炎癥加重，促使嚴重肝損害的發生。針對乙型肝炎重癥化機制的探討一直是臨床關注的焦點，目前針對HBV 變異與ACLF 相關性的研究較少，且結論存在爭議。

本研究對369 例CHB 患者和34 例ACLF 患者的A1762T/G1764A、G1896A 突變進行檢測，發現ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突變率分別為61.76%、50.00%，而CHB 患者A1762T/G1764A和G1896A 的突變率分別為59.08%、31.17%，其中G1896A 突變在ACLF 患者中顯著增高。有研究者認為ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突變率均顯著高于CHB 患者，特別是馬曉艷等發現A1762T/G1764A 突變率高達90%。閆濤等則認為ACLF 患者的A1762T/G1764A 突變率約為73.50%，且不具備ACLF 特異性。趙振剛也認為A1762T/G1764A 突變在ACLF 和CHB 患者之間無差異。Malik等對567 例印度籍HBV 感染者的病毒變異情況進行了研究，發現A1762T/G1764A 突變在CHB和暴發性肝炎中的發生率分別為33.5%和37.6%，兩組間未見顯著差異，認為A1762T/G1764A 突變與肝臟炎癥加劇無關。由此可見不同文獻對HBV 基因突變率的報道差異較大，分析原因可能與納入研究對象的選擇、地域、種族，甚至檢測手段等的不同均有關聯。

本研究結果顯示，年齡、TBiL、ALB、G1896A突變均是發生ACLF 的獨立影響因素，G1896A 突變者發生ACLF 的風險是無突變者的3.6 倍。徐航娣通過多因素分析發現T216C、G1896A、C1913A/G 和A2159G/C 均是ACLF 發病的獨立危險因素，這與本研究結論吻合，由此可見G1896A 突變與慢性乙肝重癥化密切相關。由于HBeAg 與乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）針對T 細胞表現出類似的免疫原性，故前者在某種程度上抑制細胞毒性T 淋巴細胞對肝細胞表面的HBcAg 免疫攻擊，進而誘導機體免疫耐受的產生。G1896A 突變的出現導致第28 位密碼由色氨酸TGG 突變成終止密碼TAG，減少或終止HBeAg 的合成，這將引起機體免疫系統對受感染的肝細胞發動高強度的殺傷作用，促使肝細胞大量急性壞死而發生肝衰竭。另外，HBV 基因突變還可引起調節性T 淋巴細胞、輔助性T 淋巴細胞17 表達上調，進一步加劇機體免疫狀態的失衡。既往關于A1762T/G1764A、G1896A 突變與ACLF 預后的關系也多有探討，余彩霞等認為A1762T/G1764A、G1896A 突變與預后不良有關；但肖蕾發現A1762T/G1764A、G1896A 突變可能與轉歸無關，這與本研究結論一致。

綜上，HBV 相關ACLF 患者的前C 區G1896A突變率顯著增高，G1896A 突變是ACLF 發病的獨立危險因素，而BCP 區A1762T/G1764A 突變與ACLF的關系可能并不緊密。本研究也存在一定的局限性，某些關鍵性指標如PT 由于檢測不完整，未納入最終的分析可能影響最終結果，且本研究樣本量較小，確切結論仍需大樣本、多中心、設計更合理的研究予以驗證。