結核病相關生物標志物IFN–γ檢測技術研究進展

李繼榮 王志堅

中國人民解放軍南部戰區海軍第二醫院感染科，海南三亞 572000

人類感染結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）已有數千年歷史。結核病每年造成至少120 萬人死亡。世界衛生組織提出到2030 年消除結核病大流行的目標。盡管付出巨大努力，結核病仍是世界范圍內重大公共衛生問題。

長期以來，結核菌素皮膚試驗在結核病輔助診斷中發揮著重要作用，其性價比高，操作簡便，但其結果易受卡介苗接種和非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）感染的影響；GeneXpert MTB/RIF 可同時檢測MTB 基因和利福平耐藥，2h內完成檢測，但價格昂貴，需專門檢測平臺。γ 干擾素（interferon–γ，IFN–γ）檢測可提供活動性結核、潛伏性肺結核感染病理過程和宿主免疫反應的相關信息，是結核病診斷中常規使用的生物標志物之一，對早期診斷結核至關重要。

1 傳統的IFN-γ 檢測技術

γ 干擾素釋放試驗（interferon–γ release assay，IGRA）是通過檢測單核細胞中MTB 特異性抗原（早期分泌抗原6 和培養濾液蛋白10）刺激下產生的IFN–γ 來判斷被檢測者是否存在MTB 感染。

目前有幾種較常用的方法：①采用酶聯免疫吸附測定（enzyme–linked immunosorbent assay，ELISA）檢測全血中致敏T 細胞再次受到MTB 特異性抗原刺激后釋放的IFN–γ 水平（QuantiFERON–TB Gold In Tube，QFT–GIT）。②QuantiFERON–TB Plus（QFT–Plus）是QFT–GIT 的升級版，與含有優化的CD4T 細胞刺激抗原的QFT–GIT 相比，QFT–Plus含有優化的CD4和CD8T 細胞刺激的新抗原。與QFT–GIT 相比，在成人結核潛伏感染患者中QFT–Plus 檢測顯示與MTB 暴露增加有更強的相關性，具有指示近期感染和疾病活動的潛力。③T–SPOT.TB是一種更簡單的酶聯免疫斑點試驗方法，其檢測靈敏度高，超過傳統的ELISA，用于檢測被結核特異抗原刺激活化的效應T 細胞。

IGRA 特異性更高，其陽性結果基本可排除卡介苗接種和NTM 感染，但IGRA 不能提供實時檢測，只能在實驗室進行，且操作專業要求高。因此，開發便攜式、實時、高敏感度、成本低廉、便于操作的IFN–γ 檢測技術至關重要。

2 傳感器檢測技術

由于傳統的IFN–γ 檢測技術對人員、儀器和實驗平臺要求高，因此，迫切需要設計一種高敏感度、快檢快報提供實時分析的便攜式系統。多年來，科學家們在生物傳感器領域取得了巨大的進步，并將其廣泛應用到疾病診斷相關領域。生物傳感器由生物受體和傳感器組成。生物受體是一種生物化合物（如抗體、酶、細胞、核酸等），附著于特定的分析物上。換能器是一種將生物反應轉換為可測量信號的組件。與傳統的檢測技術相比，生物傳感器具有高靈敏度和高特異性，能檢測各種復雜樣品，且操作簡便，方便攜帶，可提供實時檢測，是極富潛力的診斷方法。

2.1 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器是熒光標記和適配體傳感器的巧妙結合。以適配體作為生物識別元件的生物傳感器稱為適配體傳感器。適配體是人工合成的單鏈DNA 或RNA 分子，當與目標結合時改變其構象。近年來，由于其具有較高的化學穩定性和熱穩定性，易于修飾，對目標具有較高的特異性和親和性，重復性好，它們已成為抗體的替代品。在熒光傳感器中，對生物識別元件或目標分子進行熒光標記，熒光強度即代表目標分子與生物識別分子之間的相互作用強度。Zhang等開發了一種具有高靈敏度和高特異性的孔雀石綠–四重適配體熒光生物傳感器用于檢測IFN–γ。在實際樣品中，其檢出限為7.65fmol/L，線性范圍為0～20pmol/L，回收率為95.29%～118.08%。Wen等也開發了一種熒光傳感器，IFN–γ 檢出限為 0.175fmol/L，線性范圍為0.01pmol/L～10nmol/L。

2.2 電化學適體傳感器

電化學傳感器的原理是將生物識別元件耦合到電極換能器，然后由換能器將生物識別事件轉換成電信號。Xu等設計了一種以鏈霉素–無機雜化納米花與石墨烯復合材料作為傳感器的發夾式電化學適配體傳感器，檢測限為19fg/ml，線性范圍為0.1pg/ml～500ng/ml。Abnous等開發了一種由三螺旋分子開關系統、適配體和亞甲基藍氧化還原探針組成的電化學適體傳感器，用于快速測定IFN–γ，檢測限為3pg/ml，線性范圍為10～1 500pg/ml，回收率為91.3%～102.8%。Li等開發了一種靶誘導外切酶抑制適體傳感器，IFN–γ 檢測限為0.7pmol/L，線性范圍為1pmol/L～50nmol/L，回收率為91.83%～101.9%。該傳感器成本低、敏感度高、選擇性好、操作簡單、重復性好。Ding等制作了一種三面單層電化學適體傳感器，IFN–γ 檢出限為11.56pmol/L，線性范圍為22.22pmol/L～0.11nmol/L。Jin等制作了一種無標記電化學適配傳感器，以亞甲基藍作為氧化還原探針，其信號隨著IFN–γ 的增加而穩定提升。IFN–γ 檢出限為2fg/ml，線性范圍0.01～1000pg/ml，回收率為95.2%～105%。Cao等開發了一種可重復使用的氧化石墨烯適體傳感器裝置，IFN–γ 檢出限為1.3pg/ml，線性范圍為1.3～210pg/ml。

2.3 電化學免疫傳感器

當生物傳感器中的生物識別元件是抗體時，它被稱為免疫傳感器。免疫傳感器利用抗體與抗原的高度親和力，使用恰當的信號傳感器來確定特定的分析物。Sánchez–Tirado等設計了一種電化學免疫傳感器，用于檢測唾液中的IFN–γ。該生物傳感器的核心是三明治結構，通過重氮鹽和對氨基苯甲酸將IFN–γ 抗體固定在電極表面。檢測抗體以生物素標記，并與鏈霉素–辣根過氧化物酶耦聯。檢出限為1.6pg/ml，線性范圍為2.5～2000pg/ml。Ruecha等制作了一種無標記紙基阻抗免疫傳感器，用聚苯胺–石墨烯修飾紙基電極，并將人IFN–γ 抗體固定其上。該方法特異性、敏感度高，操作簡便，成本低。檢出限為3.4pg/ml，線性范圍為5～1000pg/ml，回收率為101%～104%。Zhang等也開發了一種由聚二烯丙基二甲基氯化銨和金納米顆粒復合材料組成的三明治式電化學免疫傳感器，檢測限為0.048pg/ml，線性范圍為0.1～104pg/ml。Parate等設計了一種可以測定細胞因子、IFN–γ 和白細胞介素–10 的免疫傳感器。該裝置檢測IFN–γ 的線性范圍為0.1～5ng/ml，檢出限為25pg/ml。

3 微流體檢測技術

近年來，在資源貧乏的國家，微流體裝置已成為一種可能的診斷工具。微流體設備是基于芯片的傳感技術，小樣本量即可提供實時的傳染病診斷。應用微流體技術可分析大量的臨床樣本，如尿液、血液或唾液。具有成本低、體積小、可批量生產的優勢。Yang等制作了一種高敏感度的微芯片電泳化學發光檢測平臺。以辣根過氧化物酶標記DNA為化學發光檢測信號探針，結合核酸外切酶信號擴增策略，實現對人血漿中IFN–γ 的快速檢測。檢測限為1.6fmol/L，線性范圍為8×10～1×10mol/L。Liu等制作了一種微流體裝置，可連續檢測血清和細胞培養中的IFN–γ。該裝置采用聚二甲基硅氧烷制作而成，利用磁場將磁性納米顆粒附著于微處理器芯片上，構建傳感檢測平臺。檢出限為6pg/ml，線性范圍為10～500pg/ml，回收率為98%～102%。Evans等設計了一個電路板傳感器檢測平臺，其檢出限為40pg/ml，線性范圍為15～2000pg/ml，回收率為93%～97%，該系統整個診斷分析過程僅需8min。

4 展望

近幾十年來，由于貧困、合并感染后的免疫抑制、抗生素濫用及結核菌耐藥等原因，結核病大有“死灰復燃”趨勢。為阻止結核病的進一步蔓延，及早發現和診斷結核成為重中之重。多年來，已有多種方法用于檢測結核病，如古老的結核菌素皮膚試驗和近些年開展起來的GeneXpert 技術，這些檢測方法都有著各自的局限性。IFN–γ 作為當前結核病早期診斷的主要生物標志物已得到廣泛應用，不僅可用于潛伏期結核感染的篩查，也可與其他方法聯合應用于活動性結核病的臨床診治。

對于IFN–γ 檢測技術的研究也一直在不斷創新和改進中。傳統的IGRA 雖然可排除卡介苗接種和NTM 干擾，特異性也較高，但費時費力，不能區分潛伏肺結核和活動性肺結核，敏感度不高（尤其在免疫功能低下群體）。隨著生物傳感檢測平臺的引進，IFN–γ 檢測的敏感度、特異性和便攜度均得到明顯提升。與傳統技術相比，生物傳感檢測平臺在檢測精度、成本和時限方面都具有顯著優勢。盡管生物傳感器有很多優點，但要將其廣泛應用于臨床實踐還有很長的路要走。在傳感系統中引入微流體技術及芯片陣列，最大限度地降低了對大型實驗設備的使用需求。然而，目前微流體技術在商業市場的應用才剛剛起步，實際應用存在諸多挑戰，如大樣本原始數據分析和大規模生產微流體裝置的成本等，都需要進一步的研究來評估其可行性。相信隨著人們對IFN–γ 檢測技術研究的不斷深入，更敏感、更高效、更便攜、更高性價比的高科技裝置會不斷涌現在人類結核病的診療實踐中。