基于熒光免疫層析技術的孕激素定量檢測儀

張長亮，龐春穎，郝浙吉

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

根據《醫藥論壇雜志》，我國新生兒每年出生數量在1 600～2 000萬之間，我國女性自然流產人數在總妊娠人數中占10%～15%［1］。其中，由黃體內分泌不足引起的流產占自然流產的20%～58%，所以對于早期孕婦體內的孕激素各項指標的監測具有重要意義。目前，對于孕激素的檢測主要采用化學免疫發光技術和膠體金免疫技術［2］。化學免疫發光技術檢測精度高，技術成熟，但檢測系統復雜，常用于醫院大型檢測設備，如羅氏COBAS 8000化學發光免疫分析儀、貝克曼DXI800免疫分析儀。膠體金免疫技術基于膠體金的顯色反應，儀器便攜性強，但只能進行定性或半定量檢測，達不到臨床檢測指標濃度的需求。

熒光免疫層析技術［3］在定量檢測領域擁有良好的應用前景，該檢測方法主要包括光電檢測法和成像式檢測法。成像式檢測法［4］利用CCD獲取熒光圖像法，進行熒光提取、分析。徐笑晗等人［5］使用CCD和手持顯微鏡設計熒光成像檢測系統，采集熒光圖像，利用圖像平均灰度值計算熒光強度。相對于成像式法，光電檢測法［6-7］避免了圖像采集及熒光信號算法提取等復雜操作過程，通過光電探測器將光信號轉換為電信號［8-10］，并通過放大電路、濾波電路對信號進行模擬處理，但該方法對機械掃描穩定性要求高，且容易受到環境光干擾。

本文研發一款基于熒光免疫層析技術的便攜式孕激素定量檢測儀，設計共聚焦式光學檢測光路系統，有效降低熒光信號的干擾，實現孕激素定量檢測系統的設計，改善膠體金類檢測儀對孕激素濃度定性或半定量檢測問題，實現家用便攜式儀器對孕激素濃度的定量檢測。

1 熒光免疫層析技術檢測原理

熒光免疫層析技術是一種基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術，該檢測技術采用熒光素標記待檢測抗原或抗體，檢測試紙條以檢測T線、質控C線的條形纖維層析材料為固相，測試液為流動相。實驗選用的熒光免疫層析檢測卡采用雙抗體夾心法研制，檢測時將待檢測液體滴加至樣品墊，檢測液中的待檢測物與玻璃纖維樣品墊上的熒光標記物結合，被熒光標記物標記的抗原經毛細管作用流經硝酸纖維素膜（NC膜），流經檢測T線處時，結合物中的檢測抗原與抗體Y1相結合，被滯留在檢測T線處。未與檢測物結合的熒光標記物流經檢測T線，到達質控C線處時與抗抗體Y2相結合，滯留在質控C線處。熒光標記物在激發光的照射下，產生微弱的熒光，熒光強度與檢測物質濃度成正相關關系，通過檢測T線和C線產生的熒光強度，進而計算被檢測樣品的濃度值，檢測原理圖如圖1所示。

2 孕激素定量檢測儀設計

儀器的設計基于熒光免疫層析檢測技術，實現激發并檢測已滴加樣品試劑卡上的熒光信號，通過處理熒光信號實現對孕激素濃度的檢測。便攜式孕激素定量檢測儀主要包括光學系統和電控系統兩部分。

2.1 光學系統

光學檢測系統的穩定性和可靠性是熒光免疫檢測儀的核心保證，其檢測精度影響系統最終檢測結果，在檢測系統的設計中起決定作用。本文設計共聚焦式光學結構的激發與熒光檢測光路，結構圖如圖2所示，可實現激發與檢測共光路工作，結構更加簡單、光線損失少、抗干擾性強、大幅提高實驗檢測精度。

圖2 共聚焦式光學結構原理圖

共聚焦式光學檢測光路工作原理如下：電控系統驅動光源產生熒光信號的激發光，激發光經準直鏡平行射入檢測光路；濾光片濾除特定波長范圍以外的雜光，保證激發光源的單色性；二向色鏡與激發光線呈45°夾角，將激發光反射到檢測卡區域；聚焦鏡將激發線匯聚到檢測試劑卡上。熒光標記物在激發光的作用下產生熒光信號；熒光經過聚焦鏡到達二向色鏡，二向色鏡對熒光波長的光具有透射作用，熒光信號透過二向色鏡；濾光片濾除熒光波長范圍以外的雜光；熒光信號經聚焦鏡匯聚到光電探測器的接收面，實現對熒光信號的采集；采集到的熒光信號經電控系統進行模擬信號處理。

系統設計數控恒流源驅動電路實現光照強度調節，選用型號為CUN66A1B的UVLED作為激發光源，發射以365 nm為中心波長的激發光；選用型號為FB360-10的激發濾光片，濾除雜光對激發光源的干擾；選用型號為MDSP425R的二向色鏡，對波長410 nm波段以下的光線反射率大于95%，對440 nm波段以上的光線透射率大于90%；聚焦鏡1孔徑為10 mm，焦距為10 mm；采集濾光片選用型號為FB610-10，濾除檢測熒光信號波段以外的光線；聚焦鏡2孔徑為10 mm，焦距為10 mm；選用型號為BPW21的硅光電二極管作為光電探測器，光譜響應范圍在350～820 nm，實現熒光信號的接收。本文設計的檢測光路結構圖如圖3所示。

圖3 系統檢測光路結構圖

檢測光路設計時考慮到機械結構穩定性及易裝調性等因素，透鏡間采用隔圈保證間隔尺寸，采用壓圈進行固定，鏡筒通過環形圈固定座固定于外殼底部。二向色鏡采用UV膠固定在L型鏡座上，鏡座通過螺釘固定于外殼底部，二向色鏡與檢測光路呈45°夾角。

系統采用固定光學檢測結構，通過步進電機推動檢測卡移動，檢測卡槽的內部設計彈片結構，當檢測卡小于檢測卡槽寬度時，可通過彈片進行固定，減少因檢測時檢測卡的不穩定移動造成的干擾。卡槽底座設計圖如圖4所示。

圖4 卡槽底座設計圖

系統檢測時，檢測樣品滴加至檢測卡樣品墊處，將檢測卡插入檢測卡槽內，通過步進電機推動滑塊系統，將檢測卡檢測條帶勻速經過光學檢測區域，完成對檢測卡待測物質的熒光信號激發與采集工作。光學檢測系統整體設計如圖5所示。

圖5 光學系統整體設計圖

2.2 電控系統

電控系統的設計主要包括主控芯片最小系統電路、激發及檢測熒光信號電路、信號I/V轉換及放大濾波電路、步進電機驅動電路和人機交互接口電路的設計，實現系統控制電路以及與各模塊之間的硬件聯系。系統硬件電路設計框圖如圖6所示。

圖6 系統硬件電路設計

系統電路的設計中，各功能模塊資源分配如下：采用 PA9、PA10的 USART1功能，通過CH340G芯片構成USB轉串口一鍵下載電路，實現程序的調試與下載，觸摸屏通信采用跳線帽轉換，實現與USB轉換電路共用USART1，進行指令發送與接收；采用PA2、PA3的USART2功能，通過SPS3232芯片構成TTL與RS232信號轉換，驅動熱敏打印機進行走紙打印；采用PG9、PG14的USART6功能，連接掃描模塊，TTL電平信號驅動掃描模塊工作；采用PA6、PA7的TIM3功能，用于控制步進電機驅動步數以及ADC采樣時間控制；采用 PB6、PB7、PB8、PB9的 TIM4功能，產生四路PWM波驅動步進電機運行；采用PF7的ADC3功能，對輸入的模擬信號進行12位模數轉換；采用PF0、PF1的IIC通信功能，向24C02芯片寫入或讀取檢測數據。

電控系統程序的設計主要包括儀器上電時系統各參數指標初始化，各項指令接收與數據發送，并執行相應功能，實現系統的有序運作。系統上電后，主程序調用初始化函數，對單片機I/O口、復用映射、定時器、串口、中斷及中斷優先級等參數進行初始化設置。系統對各項參數初始化完成后，進入等待指令模式，并對接收到的指令進行判斷，接收到完成指令，并對指令解析，執行相應功能。系統主程序執行的功能主要包括觸摸屏通信、用戶登錄、檢測條碼信息掃描、步進電機驅動信號輸出、熒光信號采集與處理、檢測結果保存以及對檢測結果進行打印。系統主程序工作流程圖如圖7所示。

圖7 系統主程序流程圖

3 實驗結果與分析

采用孕激素定量檢測儀對孕酮素濃度進行檢測與分析，并與美國貝克曼庫爾特公司生產的DXI800全自動免疫分析儀作對比分析。本文設計的孕激素定量檢測儀實物圖如圖8所示。

圖8 便攜式孕激素定量檢測系統

3.1 檢測物質濃度表達式擬合

為得到檢測熒光強度與物質濃度之間的關系，配置 12組濃度為 0、1.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、30.0 ng/mL、40.0 ng/mL、50.0 ng/mL、60.0 ng/mL、70.0 ng/mL、80.0 ng/mL、90.0 ng/mL、100.0 ng/mL的標準液樣品，滴入檢測試劑卡樣品墊檢測。根據實驗檢測到的熒光信號與待測樣品濃度的數據，采用最小二乘法進行線性擬合，所得關系表達式為：

式中，y為檢測物質濃度；x為熒光強度特征值。線性相關系數R2＞0.99，儀器在 0～100 ng/mL 濃度檢測范圍內，孕酮素濃度與熒光信號強度有良好的線性關系，可實現對檢測物質濃度的計算，其特性曲線如圖9所示。

圖9 孕酮素濃度與及熒光信號強度特性曲線

3.2 重復性測試

配置標準液濃度為5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、15.0 ng/mL三種濃度指標進行測試，每組測試重復10次，并計算檢測樣本濃度均值以及標準差。根據重復性變異系數計算公式

式中，CV為變異系數；σ為樣本標準差；為樣本平均值。計算出三種濃度指標重復性測試變異系數分別為3.7%、2.8%、1.2%，系統變異系數小于4%，其特性曲線如圖10所示，具有較好的可重復性，并且隨著檢測濃度的升高，變異系數越小，系統檢測結果越穩定。

圖10 樣本重復性測試曲線圖

3.3 誤差測試

根據標定曲線對儀器檢測誤差進行測試，配置10組濃度的樣品進行檢測，并與貝克曼檢測設備進行對比，計算檢測結果的誤差，對比結果如表1所示。

表1 孕酮素對比測試數據表

由表1所知，檢測結果中誤差最大為4.5%，符合醫學儀器設計儀器誤差不得超過10%的規定。因此，該儀器檢測精確度較好、靈敏度高，滿足臨床應用要求。

4 結論

本文采用光電檢測法，設計共聚焦式光學檢測結構，研發一款基于熒光免疫層析技術的孕激素定量檢測儀，儀器選用STM32F407微處理器作為系統控制核心，實現對女性尿液中孕激素含量的定量檢測。實驗結果表明，本文設計的便攜式孕激素檢測儀能夠對孕激素指標進行定量檢測，并達到臨床對指標檢測濃度的要求，相對于膠體金檢測法，該儀器可實現對孕激素濃度的定量檢測。系統具有檢測結果準確、穩定性高、尿檢無創等優點，具有較高的應用價值和市場發展空間。