右美托咪定對大鼠脊髓CXCR4-FAK信號通路的影響及對其神經運動功能的作用

張鮮

（南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院 藥學部，河南 南陽 473000）

中樞神經系統疾病中脊髓損傷較為常見，其主要原因是由于術中臨時阻斷胸腹主動脈導致脊髓缺血，此后血流再恢復很可能會出現更為嚴重的損傷，引發神經元凋亡甚至壞死而導致神經功能及血脊髓屏障功能等破壞，嚴重影響患者的健康和生活質量。右美托咪定具有鎮痛、鎮靜、交感神經阻滯等作用，是一種高選擇性、強效的α2-ARs 激動劑，其通過和α2A 腎上腺能受體發生反應而起到神經保護的功能。有研究表明［1］，右美托咪定能降低心、腦、腎等組織的炎性反應及氧化應激作用，從而降低組織損傷程度，保護器官功能。CXC 趨化因子受體4-粘著斑激酶（CXCR4-FAK）是重要的內源性氧化應激信號通路之一，能使骨髓間充質干細胞加速遷移至脊髓缺血再灌注損傷組織，使它們的粘附力更強，發揮對大鼠脊髓的保護作用［2］。因此本研究旨在探究右美托咪定對大鼠脊髓CXCR4-FAK 信號通路及其神經運動功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 100 只SPF 級Wistar 雄性健康大鼠，鼠齡11 周左右，體重（248±13）g，浙江省實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（浙）2008-0032。大鼠取回后能夠自主進食進水，動物存放室溫度及濕度設為25℃及40%左右。動物的使用及實驗操作按照《實驗動物管理條例》規定執行，并依照3R 原則給予動物人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑 鹽酸右美托咪定注射液，湖南科倫制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20 183149；CXCR4 激動劑Diprotin A，美國cell signal 公司，批號：A13074；細胞凋亡原位檢測（TUNEL）試劑盒，北京中山生物技術有限公司；BCA 試劑盒，碧云天生物技術有限公司；CXCR抗體、p-FAK 抗體，美國Abcam 公司產品；4%多聚甲醛，北京索萊寶科技有限公司；戊巴比妥鈉，上海上藥新亞藥業有限公司；Western blot 試劑盒，美國Abcam 公司產品。

1.1.3 主要儀器 全光譜分光光度計購自日本Thermo 公司；微量移液器購自德國Eppendorf 公司；超凈工作臺購自珠海市再鑫儀器有限公司；小型垂直電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司產品；光學顯微鏡購自上海無陌光學儀器有限公司；超速離心機購自美國Sigma 公司等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將100 只健康大鼠隨機分為模型組、實驗組（即右美托咪定組）、CXCR4-FAK 信號通路激動劑Diprotin A 組（DPA 組）及假手術組，各25 只。

1.2.2 脊髓缺血再灌注損傷大鼠模型構建［3］及藥物處理 注射麻醉后，常規消毒，采用右側臥位，再肋緣行縱切口，于顯微鏡下逐層分離，于大鼠心包處分離胸主動脈，夾逼主動脈弓鎖骨上做動脈起始點，15 min 后移除動脈夾，假手術組不做夾逼處理，術后靜脈注射氨芐青霉素以防止感染。建模成功后每只大鼠行常規飼養。實驗組在造模前3 d 鞘內注射30 μL 鹽酸右美托咪定注射液，DPA 組在造模前3 d 鞘內注射30 μL 激動劑Diprotin A，濃度均為5 μmol/L。假手術組及模型組則注射等量生理鹽水。

1.2.3 脊髓運動功能 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評估大鼠神經運動功能［4］分別于建模后與藥物干預14 d 后各組隨機選取15 只大鼠，進行BBB 評分并通過體感誘發電位監測評估大鼠脊髓功能，連續測定3 次計算平均值。

1.2.4 TUNEL［5］檢測大鼠脊髓組織細胞凋亡情況 取各組大鼠L4-6脊髓節段，制備冰凍切片，經脫蠟后，對切片沖洗后，消化15 min（置于2%的蛋白激酶K 中），重復沖洗1 次，以TUNEL 反應液緩慢滴加于其中，而后于避光孵育1 h（溫度設為37℃），再以PBS 沖洗液沖洗2 次，而后以甘油緩沖液（濃度為20%）進行封片。觀察凋亡細胞情況，于顯微鏡下隨機對6 個不同視野，而后估算凋亡細胞數。凋亡細胞數（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 檢測大鼠血清一氧化氮（NO）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）與誘導型一氧化氮合酶（iNOS）含量 于大鼠尾靜脈取血，離心后收集上清液，其中血清NO、eNOS 與iNOS 含量以比色法檢測（以硝酸還原酶法處理血清）。

1.2.6 蛋白免疫印跡（WB）法［6］檢測大鼠脊髓組織CXCR4、p-FAK 蛋白表達 將各組保存于液氮中的大鼠脊髓組織進行研磨，裂解后離心后獲得上清，提取組織總蛋白，經BCA 法定量，取50 g 樣品，常規進行檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，經系統分析各組CXCR4、p-FAK 表達情況，每個樣品進行3 次獨立重復操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對以上指標數據進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經運動功能比較

與假手術組比較，建模后、藥物干預14 d 后各組大鼠BBB 評分均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；藥物干預14 d 后模型組、實驗組及DPA 組均顯著高于同組建模后，差異有統計學意義（P＜0.05）；藥物干預14 d 后與模型組比較，實驗組、DPA 組評分均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而實驗組與DPA 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經運動功能比較（n=25,,分）

表1 各組大鼠神經運動功能比較（n=25,,分）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.2 各組大鼠脊髓組織細胞凋亡數比較

假手術組、模型組、實驗組及DPA 組大鼠脊髓組織細胞凋亡數分別為（3.11±0.55）%、（49.57±11.42）%、（36.74±10.52）%、（40.26±11.33）%，差異有統計學意義（F=111.183,P＜0.001）；與假手術組比較，模型組、實驗組及DPA 組細胞凋亡數均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組、DPA 組細胞凋亡數均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組與DPA 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠血清NO、eNOS 與iNOS 含量比較

與假手術組比較，其他各組大鼠血清NO、eNOS 水平均降低，iNOS 水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組、DPA 組血清NO、eNOS、iNOS 水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而實驗組與DPA 組上述各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清NO、eNOS 與iNOS 含量比較（n=25,）

表2 各組大鼠血清NO、eNOS 與iNOS 含量比較（n=25,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.4 各組大鼠脊髓組織CXCR4、p-FAK 蛋白表達情況比較

與假手術組比較，其他各組大鼠脊髓組織CXCR4、p-FAK 蛋白表達量升高較明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組、DPA 組CXCR4、p-FAK 蛋白表達量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而實驗組與DPA 組CXCR4、p-FAK 蛋白表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠脊髓組織CXCR4、P-FAK 蛋白表達情況比較（n=25,）

表3 各組大鼠脊髓組織CXCR4、P-FAK 蛋白表達情況比較（n=25,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

3 討論

脊髓損傷會導致不同程度的神經元與神經膠質細胞壞死，其中缺血再灌注損傷為繼發性損傷，會誘導患者出現炎性反應、細胞凋亡、神經肽異常釋放等現象，導致細胞及其組織環境改變，進而使細胞難以維持血液-脊髓屏障的完整性，導致患者出現神經運動功能障礙［7］。研究證實［8］，右美托咪定是一種α2 腎上腺素能受體激動劑，其不僅具有強效、高選擇性，還有抗焦慮、鎮靜、抗感染、抗凋亡、中樞性抗交感等作用。劉煜鑫等［9］研究稱，右美托咪定科作用于藍斑突觸前神經末梢受體，對興奮性氨基酸、兒茶酚胺等的釋放有抑制作用，使神經元凋亡的速度減緩，還可加速細胞外調節蛋白激素酶1 及蛋白激素酶2 的磷酸化，從而有效保護神經功能。本研究中建模后及藥物干預后各組大鼠BBB 評分均較假手術組顯著降低，藥物干預后模型組、實驗組及DPA 組均顯著高于建模后各組，而實驗組與DPA 組間比較差異不顯著，提示右美托咪定對大鼠脊髓神經運動功能具有較好的保護作用。

CXCR4 為基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）特異性受體，作為啟動因子，對骨髓源性細胞遷移、粘附有介導作用，SDF-1α 與CXCR4 結合，而后誘導異源三聚體G 蛋白激活，再通過Gi 亞基激活其下游的胞質酪氨酸蛋白酶（FAK），促使其磷酸化生成p-FAK；有研究稱［10］，p-FAK 是由SDF-1α/CXCR4 信號級聯激活后產生的，它一方面作為蛋白支架，能與CXCR4 的Gs 亞基很好結合，給下游的Rho 激酶等效應分子傳遞濃度信號，進而誘導SDF-1α 對細胞產生趨化作用，另一方面通過活化磷脂酰基醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白酶（PI3K/AKt），從而促進胞膜上整合素β1 分子表達上調，進而增強細胞與細胞外基質主要成分的粘附能力，以抵抗異常細胞的凋亡；有研究表明［11］，AKt 磷酸后可對eNOS 有激活作用，生成的eNOS會抑制NO 合成，對NO 含量有調控作用，同時對蛋白酶和線粒體ATP 敏感性鉀離子通道進行激活，使線粒體功能得到改善，從而抑制細胞凋亡，此外對正常機體來說，iNOS 表達量較少，當受到外界刺激或損傷后，其表達量會增多，從而導致NO的大量產生；右美托咪定可減少細胞損傷和衰退，增加腦源性神經營養因子的產生。細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷密切相關，其導致細胞損傷的機制與自由基產生過多及鈣超載有關，其中Ca2＋活化NOS 導致NO 生成量增多而介導氧化損傷和細胞凋亡。本研究結果中，與假手術組比較，模型組、實驗組及DPA 組細胞凋亡數均升高（P＜0.05），與模型組比較，實驗組、DPA 組細胞凋亡數均降低（P＜0.05）；與假手術組比較，其他各組大鼠血清NO、eNOS 水平均降低，iNOS 水平升高（P＜0.05），與模型組比較，實驗組、DPA 組血清NO、eNOS、iNOS 水平均降低（P＜0.05），而實驗組與DPA 組血清NO、eNOS、iNOS 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與假手術組比較，其他各組大鼠脊髓組織CXCR4、p-FAK 蛋白表達量升高較明顯（P＜0.05），與模型組比較，實驗組、DPA 組CXCR4、p-FAK 蛋白表達量均升高（P＜0.05），而實驗組與DPA 組CXCR4、p-FAK 蛋白表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。可以推測右美托咪定可通過激活CXCR4-FAK 信號通路對脊髓缺血再灌注損傷大鼠脊柱有很好的保護作用。

綜上所述，右美托咪定可通過激活CXCR4-FAK 信號通路，抑制脊髓損傷所致的細胞凋亡，改善受損脊髓組織，促進神經運動功能恢復。