梅花鹿茸不同生長時期轉錄組及蛋白組聯合分析

慧 芳，孫天霞，薛東明，姜英男，趙 雨

（長春中醫藥大學人參科學研究院，長春 130117）

梅花鹿茸系鹿科動物梅花鹿（Cervus nipponTemminck）雄性未骨化帶有密生茸毛的幼角，也是獨特的哺乳動物的附屬肢體[1]。鹿茸的生長速度非?？?，是唯一一個每年都會脫落后能完全再生的哺乳動物器官[2]。

鹿茸再生的組織基礎為生茸區骨膜（antlerogenic periosteum，AP），AP衍生出角柄骨膜（pedicle periosteum，PP），而鹿茸的生長中心則是由角柄骨膜細胞發育而來的[3-4]。鹿茸在脫盤后開始生長，生長速度逐漸加快。在60 d 后，由于生茸區的骨膜中的間充質干細胞的周期性被激活，鹿茸進入了快速生長期[4-5]，90 d 后，鹿茸進入了快速骨化期，經歷了軟骨內骨化過程[6]。

研究表明，有很多因素如激素、細胞因子、轉錄因子都參與到鹿茸生長發育過程的調控。其中主要調控快速生長及骨化的激素為雄激素，除了雄激素外，甲狀腺激素[7]、甲狀旁腺素[8]、卵泡刺激素、黃體生成素、腎上腺皮質激素、催乳素、雌二醇、孕激素、視黃酸[9]、絨毛膜促性腺激素[10]、褪黑激素[11]等也在鹿茸生長發育過程中起重要的調節作用。

除激素調控外，多種細胞因子也參與鹿茸生長發育過程，如胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子β1（TGF-β1）通過促進鹿茸細胞的增殖分裂，調控鹿茸的生長速度[12-16]。一些轉錄因子也參與到了鹿茸軟骨內骨化過程，如cAMP反應元件結合蛋白、Sox 家族、活化蛋白-1、Runx2 轉錄因子、C-myc 轉錄因子[17-20]。鹿茸生長發育過程中還伴隨著神經和血管的快速生長，神經生長因子參與了鹿茸神經的生長，具有促進鹿茸的神經元生長、發育、再生的作用[21-22]。成纖維生長因子和血管生成素通過激發鹿茸血管生成參與到鹿茸快速生長期和骨化期的調控。

由此可看出，鹿茸具有獨特生物學特性，且調控機制復雜。雖然對鹿茸生長發育的組織學研究已有較好的基礎，但其具體分子機制還未闡明，生長發育相關的關鍵蛋白和信號調控網絡也不清晰。隨著組學技術的發展，研究者可獲得大量的數據，通過對組學數據的挖掘，進行更深入的機制研究。特別是利用各個組學數據之間的互補性和相似性，綜合分析多組學數據，可以進行更加全面、系統的闡明鹿茸生長發育的機制。

本研究采用 Illumina HiSeq 測序技術和iTRAQ 技術，對處于初生期、快速生長期和骨化期鹿茸頂端組織進行轉錄組和蛋白組測序并進行聯合分析，以期為鹿茸生長發育機制的研究提供依據。

1 材料

本研究選取4 歲齡健康的東北梅花鹿茸頂端組織為研究對象，鹿茸樣品采集于吉林省雙陽市鹿鄉鎮。分別采集初生期、快速生長期和骨化期鹿茸的頂端組織，每個時期隨機選取3 只進行取樣。

2 方法

2.1 RNA 提取及轉錄組測序 提取鹿茸組織的RNA。通過NanoDrop 2000 和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質量后，用DNase I 消化DNA 后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA 為模板，合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復、cDNA 的3’末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段分選，最后進行PCR 擴增；構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 質檢合格后，上機測序。

2.2 基因表達及差異基因分析 采用RPKM 法[23]（Fragment Per Kilo bases per Million reads）計算基因的表達量。按照Audic S[24]等方法進行差異基因的篩選，進行多重假設檢驗校正，控制整體的錯誤發生率。

2.3 蛋白質定量及鑒別 用Mascot2.3.02 對蛋白進行鑒定和定量，不同樣本之間對差異蛋白的定義為：當差異倍數達到1.2倍以上，且經統計檢驗其P值小于0.05時，視為差異蛋白。

2.4 差異基因和差異蛋白的KEGG 富集 應用超幾何檢驗，找出與所有基因組和蛋白質背景相比，在差異基因和差異蛋白中顯著性富集的Pathway。根據公式計算出差異基因和蛋白的P 值，以P-value ≤0.05 為閾值，滿足此條件的定義為在差異蛋白質中顯著富集的Pathway。

2.5 相關性分析 采用 SPSS 22.0 軟件對轉錄組和蛋白組的差異基因和差異蛋白進行相關性分析。

3 結果

3.1 差異基因和差異蛋白鑒定 本研究中的差異表達基因定義為FDR ≤0.001 且倍數差異在2 倍以上的基因。PSvsRG 組共得到11 294 個顯著差異基因（DEGs），其中7 954 個基因顯著上調，3 340 個基因顯著下調；PSvsOS 組共有4 924 個DEGs，其中2 402 個基因顯著上調，2 522 個基因顯著下調。結果顯示鹿茸不同生長時期有大量差異基因表達，且在快速生長期差異基因較多（圖1）。

PSvsRG 組共得到236 個差異蛋白（DAPs）；其中138 個上調蛋白，98 個下調蛋白。PSvsOS 組共獲得211 個DAPs，其中，有121 個上調蛋白，90 個下調蛋白（圖1)。這些結果表明，許多蛋白質在鹿茸快速生長期和骨化期表現出不同的豐度（圖1）。

圖1 鹿茸中表達有差異表達的基因和蛋白質

3.2 蛋白豐度和基因表達水平相關性分析 經過進一步篩選后，發現在PSvsRG 和PSvsOS 組中，分別有54、51 個DEGs 編碼了其相應的DAPs（圖2）。所以為了分析鹿茸生長過程中轉錄組和蛋白質組變化之間的一致性，本研究使用篩選出的54 和51 個DGEs 及其相應的DAPs 的數據進行了相關性分析（圖3，圖4）。Pearson 相關性檢驗表明，在PSvsRG 中，DEGs與相應DAPs 的Log2fold change 呈正相關，皮爾森系數為0.070（圖3）；在PSvsOS 中，DEGs 及其相應的DAPs 的Log2fold change 呈負相關，皮爾森系數為-0.229（圖4）。結果顯示，轉錄組和蛋白組相關性較差，呈弱相關。這可能是由于轉錄水平的波動比蛋白質的翻譯和修飾過程的波動更快。

圖2 差異蛋白和差異基因的維恩圖

圖3 PSvsRG 組中DEGs 和DAPs 轉錄水平與蛋白豐度的相關性

圖4 PSvsOS 組中DEGs 和DAPs 轉錄水平與蛋白豐度的相關性

3.3 鹿茸生長發育相關候選基因/蛋白鑒定 去掉快速生長期在轉錄和蛋白水平調節方向相反的基因和蛋白后，獲得了35 個DEGs 及其相應的DAPs，其中，上調基因/蛋白有27 個；下調基因/蛋白有8 個。去掉骨化期在轉錄和蛋白水平調節方向相反的基因和蛋白后，獲得20 個基因和蛋白。其中，發現上調的基因/蛋白6 個，下調基因/蛋白14 個。

在鹿茸快速生長期和骨化期有3 個基因/蛋白一直處于上調狀態，它們包括：Ⅰ型角蛋白（KRT1）、IX 型膠原（COL9A）、凝血酶敏感蛋白2（THBS2S）。還有4 個基因/蛋白呈下調趨勢，它們包括：組蛋白H4（H4）、組蛋白H2A（H2A）、鈣調結合蛋白（CALD1）。除了在2 個時期共同富集到基因的外，本研究還關注了只在快速生長期或骨化期表達的基因，其中，在快速生長期上調基因包括：I 型膠原蛋白α 鏈（COL1A）、軟骨可聚蛋白多糖（AGC1）、基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白（HSPG2）等。顯著下調基因為果糖-二磷酸醛縮酶（ALDO）。在骨化期顯著上調基因包括為信號調節蛋白（SIRPA），顯著下調基因包括：富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質（CSRP）、肌球蛋白重鏈9（MYH9）、肽酰脯氨基順反異構酶B（PPIB）、組蛋白H1/5（H1-5）。

3.4 鹿茸生長發育相關候選通路篩選 對快速生長期和骨化期候選基因/蛋白進行KEGG 富集分析，結果顯示，在快速生長期候選基因/蛋白中有共有7 個基因/蛋白注釋到了10 個信號通路。骨化期候選基因/蛋白有7 個基因/蛋白富集到12 個通路。其中，2 個時期共同富集到6 個信號通路，包括：粘著斑、ECM-受體相互作用、TGF-β 信號通路、p53 信號通路、血管平滑肌收縮、蛋白質消化吸收通路。而共同富集到以上6 個信號通路的基因/蛋白為CALD1、THBS2S、COL9A。

除了共同富集到的信號通路和基因/蛋白外，在快速生長期還富集到了戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、代謝途徑等通路。其中，有3 個基因/蛋白只在快速生長期表達，它們是ALDO（下調）、COL1A（上調）、HSPG2（上調）。

在骨化期富集還到了破骨細胞分化、肌動蛋白細胞骨架的調節、緊密連接、RNA 轉運、mRNA 監測途徑信號通路。其中有4 個基因/蛋白只在骨化期表達，包括：SIRPA（上調），顯著下調基因包括：CSRP（下調）、MYH9（下調）、H1-5（下調）。

4 討論

與低級脊椎動物和無脊椎動物相比，哺乳動物的再生能力非常有限，而鹿茸是一種可以周期性完全再生的器官，而鹿茸再生的調控機制不甚清晰，如果可以闡明鹿茸再生過程的分子調節機制，對于肢體再生、器官移植及骨病治療有著重要意義。

本研究結果顯示，粘著斑、ECM-受體相互作用、TGF-β 信號通路、p53 信號通路、血管平滑肌收縮、蛋白質消化吸收通路共同參與到了鹿茸快速生長和骨化期的調控。

在鹿茸快速生長期，產生了高強度的機械張力使鹿茸血管、皮膚和神經快速生長，骨化期涉及到軟骨內成骨和膜內成骨過程。而本研究中共同富集兩個時期的基因/蛋白（THBS2S、CALD1、COL9A）參與了鹿茸組織細胞內的信號傳遞、細胞增殖、成骨分化和血管生成等過程。

除了共同富集到的信號通路和基因/蛋白外。本研究還發現了只在快速生長期和骨化期表達的基因/蛋白。

在快速生長期富集到了與糖代謝（ALDO）和細胞外基質（ECM）的相關蛋白（HSPG2）。研究顯示，在軟骨發育過程中，信號分子嚴格調控葡萄糖的吸收和利用。糖代謝的紊亂會影響軟骨細胞的成熟過程[25]。ECM 由結構性和功能性大分子化合物組成，包括膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、非膠原糖蛋白[26]。在骨骼中，ECM 介導細胞粘附，機械傳導，礦化成核等過程。在本研究中發現，有膠原蛋白、蛋白聚糖的表達。我們認為在鹿茸生長發育中糖代謝及ECM 通路具有重要作用，可能通過激活胞內信號傳遞的連鎖反應從而調控著多種與鹿茸生長發育有關的信號通路。

在骨化期富集到的基因/蛋白主要與破骨細胞分化和細胞骨架調節（SIRPA、CSRP、MYH9、H1-5）有關，這些蛋白可能通過調節破骨細胞活性或激活成骨分化相關通路參與了鹿茸的成骨過程。

在現代醫學上，鹿茸不僅是再生模型，還是一種被人們認可的滋補中藥，隨著生命科學研究進入組學時代，組學技術飛快發展，加速了對鹿茸生長發育的研究。綜合分析多組學的研究數據可以根據組學數據之間的相似性和互補性更深層次的從多角度、多層次、系統地闡明鹿茸再生和快速生長發育機制。本研究以不同生長時期鹿茸為樣品，對其進行轉錄組和蛋白組測序，篩選出與鹿茸生長發育相關的基因及蛋白質，以期為鹿茸生長發育機制的研究提供依據。