基于網絡藥理學分析黃芩素降低血壓和調控炎癥的作用機制*

張鈴 劉菲 曾建偉 趙春雨 熊曉滿 林珊 黃彬 ，2 陳達鑫 林育鵬 蔡巧燕 #

（1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室 福州 350122；3 福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室 福州 350122；4 福建中醫藥大學中西醫結合學院 福州 350122）

據統計，全球有超過15 億人患有高血壓，且呈年輕化趨勢[1]。高血壓是一種低級別炎癥的慢性疾病，其發生發展伴隨著炎癥細胞的持續激活，是心臟病、腦卒中、慢性腎病、外周動脈疾病等最主要的危險因素之一。研究表明，有效抑制炎癥反應可以阻滯高血壓的進展[2]。目前許多中藥在抗炎方面發揮了良好的療效，如丹參[3]、苦參[4]、肉桂[5]、黃芩[6]等。其中，黃芩是一種傳統中藥，其味苦、性寒，歸肺、心、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火、解毒、止血等功效，在臨床上用于高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的治療[7]。而黃芩素是從黃芩干燥根中提取出的一種黃酮類化合物，其能通過多靶點、多通路起到抗炎、抗氧化、保肝、利尿、抗癌等功效[8]。在高血壓的相關研究中發現，黃芩素通過促進內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶（eNOS）重組蛋白表達與一氧化氮（NO）釋放，可增強乙酰膽堿對血管的舒張作用[9]，但其對高血壓所致炎癥反應的調控作用未見報道。本研究以AngⅡ誘導的高血壓小鼠作為研究對象，明確了黃芩素降低血壓及調控血清中炎癥相關因子表達的藥效作用，并進一步通過網絡藥理學探討其治療高血壓的潛在機制。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 雄性 C57BL/6 小鼠，SPF 級別，7 周齡，購自于上海斯萊克公司，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房觀察室。實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物配制 黃芩素購買于上海源葉生物科技有限公司，用0.9%氯化鈉溶液超聲助解，現配現用。1.3 主要儀器與試劑 Coda 血壓測量儀購自于美國Kent Scientific 公司；Bio-Plex 懸液芯片系統購自于美國Bio-Rad 公司；Alzet Osmotic Pump（型號：2004）購自于美國Alzet 公司；AngⅡ粉末購自于美國Abcam 公司；Bio-Plex Pro assays 試劑盒購自于美國Bio-Rad 公司。

1.4 AngⅡ誘導的高血壓小鼠模型的構建 采用皮下植入AngⅡ1 000 ng（/kg·min）緩釋微型注射泵的方式構建高血壓小鼠模型。具體操作如下：在小鼠的右側背部后的兩側肩胛骨中間做一長約1.0～2.0 cm 的縱行皮膚切口，沿皮下組織游離，游離至左側頸部皮下，將預裝好的微量泵埋入到切口對側皮下，用針、線縫合皮膚切口，并用碘伏進行消毒處理。把做完手術的小鼠放在電熱毯上保溫，防止死亡，直到小鼠麻醉清醒，再放回籠子里。

1.5 動物分組和給藥 隨機將小鼠分成對照組、AngⅡ組和AngⅡ+黃芩素組，每組各8 只。黃芩素的給藥劑量為：5 mg（/kg·d）。于術后第1 天開始給藥，1 次/d，每次灌胃0.3 ml，連續灌胃28 d。對照組和AngⅡ組同步給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.6 鼠尾無創血壓儀測量血壓 手術前測量基礎血壓，在黃芩素干預后第7、14、21、28 天測量血壓。血壓檢測步驟如下：將Coda 血壓測量系統安裝好，包括加熱板、壓差傳感器裝置、裝有Coda 軟件的電腦等，打開電源和開關。誘使小鼠鉆進固鼠器，固定完畢后放于加熱板上加熱，固定器和小鼠尾部均在加熱板上，讓小鼠穩定約3 min。將大小合適的尾袖套在小鼠尾巴根部，設置好電腦上的Coda 軟件后開始測定，每只小鼠預測定10 次，正式測定15 次，每次30 s，記錄合格小鼠的收縮壓、舒張壓數據，并計算其平均動脈壓，平均動脈壓=（收縮壓+2×舒張壓）/3。

1.7 Bio-Plex Pro assays 試劑盒檢測血清中炎癥相關因子的表達 往96 孔板中加入50 μl 1×與抗體偶聯的微球，用wash buffer 洗板2 次。分別將50 μl的標準品、樣本、Blank 加入到對應的孔中，900 rpm室溫避光孵育30 min。用wash buffer 洗板2 次，再加入25 μl 1×檢測抗體，900 rpm 室溫避光孵育30 min。用 wash buffer 洗板 3 次，加入 50 μl 鏈霉親和素 -PE，900 rpm 室溫避光孵育 10 min。用 wash buffer 洗板 3 次，加入 125 μl 的 assay buffer，900 rpm 室溫避光振蕩30 s，于Bio-Plex 200 分析儀上機檢測，使用Bio-Plex Manager 軟件分析每個炎癥相關因子相對的熒光強度，通過標準曲線計算對應的濃度。

1.8 黃芩素作用靶點基因與高血壓疾病相關靶點基因的提取與交集 通過ETCM、TCMSP 數據庫檢索黃芩素的潛在作用靶點基因；以“hypertension”為關鍵詞，在Disgenet、OMIM 等數據庫中進行檢索，以獲得高血壓疾病相關靶點基因；采用Draw Venny Diagram 在線程序將黃芩素和高血壓靶基因取交集，獲得兩者共有的靶點，此集合為黃芩素治療高血壓疾病的可能潛在作用靶點。

1.9 KEGG 分析 將黃芩素和高血壓靶基因取交集后取得的潛在作用靶點導入到David 數據庫中，分析獲得KEGG 通路富集的氣泡圖及關鍵信號通路（只展示前20 條具有統計學意義的顯著性結果）。1.10 數據整理與統計分析 所有實驗結果均采用SPSS15.0 軟件進行統計學處理，實驗結果用（）表示。多組數據間比較，符合正態分布且方差齊的，采用單因素方差（ANOVA）分析。若不符合正態性分布，則使用非參數檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對AngⅡ誘導的高血壓小鼠血壓的影響 與對照組比較，AngⅡ組小鼠在第1～4 周的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著升高（P＜0.05），表明高血壓小鼠模型構建成功，且持續穩定；在給藥2 周后，與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芩素組小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著降低（P＜0.05），表明黃芩素能顯著抑制AngⅡ誘導的高血壓小鼠血壓的升高。見圖1。

圖1 黃芩素對AngⅡ誘導的高血壓小鼠血壓的影響

2.2 黃芩素對AngⅡ誘導的高血壓小鼠血清中炎癥相關因子表達的影響 與對照組比較，AngⅡ組小鼠血清中的白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白介素 -1α（IL-1α）、單核細胞趨化蛋白 -1α（MIP-1α）、T 細胞激活分泌調節因子（RANTES）的表達均顯著升高（P＜0.05），IL-10 的表達則顯著降低（P＜0.05）；而黃芩素干預后，能顯著降低AngⅡ誘導的高血壓小鼠血清中IL-6 和MCP-1 的表達（P＜0.05），升高IL-10 的 表 達 （P ＜0.05）， 但 對 TNF-α、IL-1α、MIP-1α、RANTES 的表達沒有顯著影響（P＞0.05）。見圖2。

圖2 黃芩素對AngⅡ誘導的高血壓小鼠血清中炎癥相關因子表達的影響

2.3 黃芩素作用靶點、 高血壓疾病作用靶點的Venn 分析 從ETCM、TCMSP 數據庫搜集到的黃芩素潛在作用靶點基因共有72 個，從Disgenet、OMIM 等數據庫搜集到的高血壓疾病靶點基因共有9 032 個。對兩者的靶點基因進行Venn 分析，獲得的交集靶點基因共有58 個。見圖3。

圖3 黃芩素與高血壓交集靶點的韋恩圖

2.4 黃芩素治療高血壓的KEGG 通路富集分析黃芩素治療高血壓的潛在靶點涉及到的信號通路包括代謝途徑、氮代謝、JAK-STAT 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、趨化因子信號通路等。見圖4。

圖4 黃芩素治療高血壓的KEGG 通路富集分析

3 討論

高血壓是一種復雜的慢性疾病，是心腦血管疾病、慢性腎病和全因死亡的危險因素，其發病機制與腎 素 - 血 管 緊 張 素 - 醛 固 酮 系 統（Renin-Angiotensin-Aldosterone System, RAAS）密切相關[10]。AngⅡ是RAAS 系統中的重要效應因子，它能刺激醛固酮的分泌，從而增強腎小管對鈉和水的再吸收，引起水鈉潴留，導致血管內積液量增加，血壓升高[11]。本研究利用AngⅡ皮下埋泵灌注的方式建立了高血壓小鼠模型，結果表明在造模的28 d內，AngⅡ組小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均持續、穩定升高。而經黃芩素干預2 周后，AngⅡ誘導的高血壓小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著降低，表明黃芩素具有良好的降壓療效。苗杰[12]研究表明黃芩素干預4 d 后就能顯著降低AngⅡ誘導的高血壓小鼠收縮壓，但對舒張壓及平均動脈壓的影響尚未闡明。該研究實驗結果與我們的研究結果一致，但黃芩素起效時間有所差別。該研究造模采用的AngⅡ劑量為1 200 ng/（kg·min），而本研究采用的AngⅡ劑量為1 000 ng/（kg·min）；并且黃芩素給藥方式及劑量也存在差別，該研究采用每天腹腔注射25 mg/kg 的黃芩素，而本研究采用每天灌胃5 mg/kg 的黃芩素。因此，本研究黃芩素發揮藥效的作用時間有所延遲。

近年來，越來越多的證據表明高血壓在發生發展的過程中會造成全身低級別的炎癥反應，同時，炎癥反應也會加劇高血壓的進展[13～14]。目前許多炎癥因子和趨化因子已經被證實與高血壓密切有關，其中包括 IL-6、MCP-1、TNF-α 和 IL-10 等[15]。如有報道顯示：IL-6 可能是健康人群高血壓的高度獨立危險因素，并發現這些細胞因子的高表達與高血壓靶器官損傷呈正相關[16]；MCP-1 的缺失或阻斷能有效降低血壓，減輕血管和腎臟炎癥反應[17]；IL-10 在AngⅡ誘導的鹽敏感性高血壓和腎損傷中發揮著保護作用[18]。本研究表明，在AngⅡ誘導的高血壓小鼠血清中，其促炎因子及趨化因子 IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1α、MIP-1α、RANTES 的表達均顯著高于對照組，但血清中抑炎因子IL-10 的含量顯著低于對照組。而黃芩素干預顯著降低AngⅡ誘導的高血壓小鼠血清中IL-6、MCP-1 的表達，升高IL-10 的表達，證明了黃芩素具有顯著抗炎的功效，但其具體的調控機制尚不清楚，因此我們通過網絡藥理學初步探索了其可能的潛在作用機制。

通過數據庫分別搜集到黃芩素及高血壓疾病的潛在作用靶點，并對兩者取交集，發現了58 個共有靶點，并對這些共有靶點進行KEGG 分析，發現這些靶點涉及到代謝途徑、氮代謝、JAK-STAT 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、趨化因子信號通路等多條通路。其中PI3K-AKT 信號通路能激活下游NF-κB信號通路依賴性的轉錄，進而促進炎癥相關因子表達的升高[19]；JAK-STAT 信號通路作為應激的炎癥信號通路，可以激活炎癥因子相關基因轉錄，引起炎癥因子級聯反應，加速疾病的進程[20]。趨化因子是一類能誘導白細胞歸巢的細胞因子。如MCP-1 通過結合其受體CCR2，從而誘導單核-巨噬細胞、T 淋巴細胞遷移到炎癥部位，是炎癥反應的始動因子，且參與了高血壓的發生發展及靶器官（血管、心臟、腦）的損傷[21]。因此，本研究證實了黃芩素除了能調控血壓升高外，還具有顯著降低炎癥反應的功效，但其是否與調控JAK-STAT、PI3K-AKT 和趨化因子信號通路等有關，還有待進一步的實驗驗證。