熟地黃對6-羥基多巴胺誘導的多巴胺能神經細胞氧化應激的影響

王家鵬 孫曉杰

(山東中醫藥高等專科學校 1中醫系，山東 煙臺 264199；2招生就業處)

帕金森病是一種神經退行性疾病，其病理特征為腦黑質致密區域多巴胺能神經元缺失，神經元缺失可誘導紋狀體多巴胺異常減少，誘導基底神經節異常，進而誘發行動遲緩、平衡功能障礙、肢體僵硬等運動癥狀，氧化應激被認為是多巴胺能神經細胞功能紊亂的重要原因〔1〕。目前常見的帕金森病治療藥物有多巴胺受體激動藥、抗膽堿藥等，這些藥物多數為對癥治療，只能部分改善運動缺陷，且不能阻止病情進展，研發有效藥物改善帕金森病備受關注〔2〕。熟地黃是玄參科植物地黃塊根經過炮制加工而成，具有抗衰老、抗氧化、改善記憶力、調節免疫等作用〔3〕。有研究〔4〕顯示，熟地黃能夠緩解帕金森病模型大鼠異動癥狀。現階段尚不清楚熟地黃對6-羥基多巴胺(OHDA)誘導的多巴胺能神經細胞的影響。本實驗研究熟地黃對6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞氧化應激的影響和機制。

1 材料與方法

1.1材料 細胞：多巴胺能神經細胞SH-SY5Y(貨號：258028)購自寧波明舟生物科技有限公司。多巴胺能神經細胞SH-SY5Y培養在含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液內，細胞培養條件為37℃，飽和濕度，5% CO2培養箱。藥物：熟地黃(北京索萊寶科技有限公司，編號：DYS8270，規格：1 g)。試劑與儀器：6-OHDA(Sigma公司，美國，貨號：H4381-100MG)；p38MAPK激活劑Anisomycin(Sigma公司，美國，貨號：A5862-0.5ML)；兔抗p-p38MAPK抗體(Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：4511)；活性氧(ROS)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：HR8786)；兔抗剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體(Abcam公司，美國，貨號：ab2302)；兔抗p38MAPK抗體(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：YT820)；兔抗Ki-67抗體(Abgent公司，美國，貨號：A-AJ1427c)；丙二醛(MDA)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC0020)；DMEM培養基(Sigma公司，美國，貨號：DF-042-B)；兔抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(Abcam公司，美國，貨號：ab53154)；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，貨號：S0101S)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：11011-8611)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，貨號：C0017)；流式細胞儀(Becton，Dickinson and Company公司，美國，LSRFortessa X-20型)；酶標儀(北京普凱瑞生物科技有限公司，SpectraMax iD5型)。

1.2分組及給藥方法 取處于對數生長期的多巴胺能神經細胞，根據不同的實驗需求接種到細胞培養板內，24 h后，添加不同濃度的含藥培養液，對照組細胞培養液不添加任何藥物，6-OHDA組、熟地黃低劑量組、熟地黃中劑量組、熟地黃高劑量組、熟地黃高劑量+Anisomycin組細胞培養液中均添加100 μmol/L的6-OHDA〔5〕，同時熟地黃低、中、高劑量組細胞培養液中分別添加120、240、480 μmol/L的熟地黃，熟地黃高劑量+Anisomycin組細胞培養液中添加480 μmol/L的熟地黃和2 ng/ml的p38MAPK激活劑Anisomycin〔6〕。各組細胞培養24 h后進行相關檢測。

1.3檢測指標與方法 (1)CCK-8實驗檢測細胞增殖：多巴胺能神經細胞按照每個孔內4 000個細胞接種到96孔板內，細胞培養24 h后，分別在每個孔內添加10 μl CCK-8溶液，繼續孵育10 min，用酶標儀測定波長為450 nm的吸光度(OD)值，以OD值表示細胞增殖活性。(2)Western印跡檢測相關蛋白表達：多巴胺能神經細胞按照每個孔內接種5×104個細胞接種到24孔板內，24 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，添加含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)溶液，放在冰上裂解，30 min后，在4℃條件下高速離心，收集蛋白上清，經二喹啉甲酸(BCA)方法檢測蛋白濃度后，與2倍結合緩沖液混合煮沸5 min。在每個十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣孔內添加40 μg蛋白樣品，先以90 V的電壓電泳30 min后，再以120 V的電壓電泳1.5 h。以200 mA恒流轉膜1.5 h。將NC膜放置5%牛血清白蛋白溶液中封閉2 h。NC膜放在一抗溶液(p-p38MAPK、酶切Caspase-3抗體以1∶800稀釋，p38MAPK抗體以1∶1 500稀釋，Ki-67、Bax抗體以1∶1 000稀釋)中，4℃搖床過夜。NC膜放在1∶2 000稀釋后的二抗溶液內，在室溫中結合2 h。ECL發光。Image J分析比較灰度值，以GAPDH校正。(3)流式細胞術檢測凋亡：多巴胺能神經細胞按照每個孔內接種5×104個細胞接種到24孔板內，24 h后，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，每個測定樣品取1×106個細胞，懸浮于500 μl的結合緩沖液中，分別添加5 μl的膜連蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)溶液，轉移至避光條件下結合20 min，用流式細胞儀檢測凋亡變化。(4)ROS、MDA、SOD含量和培養液上清中LDH檢測：多巴胺能神經細胞按照每個孔內接種5×104個細胞接種到24孔板內，24 h后，收集細胞和培養液上清，以ROS檢測試劑盒(CellROX Green熒光探針法)、MDA檢測試劑盒(可見分光光度法)、SOD檢測試劑盒(黃嘌呤氧化法)分別測定細胞中ROS、MDA、SOD含量，ROS檢測結果以對照組為參照，分析其余各組ROS含量變化百分比；以LDH檢測試劑盒(比色法)測定培養液上清中LDH含量，步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.4統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1熟地黃對多巴胺能神經細胞增殖影響 與0 μmol/L(0.56±0.06)比較，120、240、480 μmol/L的熟地黃處理后多巴胺能神經細胞增殖活性(0.51±0.08、0.49±0.06、0.47±0.07)沒有變化(P>0.05)；960、1 920 μmol/L熟地黃處理后多巴胺能神經細胞增殖活性(0.40±0.06、0.32±0.04)顯著降低(P<0.05)。選擇對多巴胺能神經細胞沒有毒性的120、240、480 μmol/L的熟地黃進行后續實驗。

2.2熟地黃可抑制6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞中p38MAPK信號激活 與對照組(0.15±0.03)比較，6-OHDA組多巴胺能神經細胞中p-p38MAPK/p38MAPK表達量(0.89±0.09)顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組表達量(0.63±0.05、0.41±0.03、0.29±0.02)逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組表達量(0.45±0.06)顯著升高(P<0.05)。見圖1。

1～6：對照組、6-OHDA組、熟地黃低劑量組、熟地黃中劑量組、熟地黃高劑量組、熟地黃高劑量+Anisomycin組；同下圖圖1 各組多巴胺能神經細胞中p38MAPK信號 相關蛋白表達

2.3熟地黃調控p38MAPK對6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞增殖、凋亡影響 與對照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經細胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經細胞增殖活性逐漸顯著升高，凋亡率逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經細胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 各組多巴胺能神經細胞凋亡情況

表1 各組多巴胺能神經細胞增殖活性和凋亡率及Ki-67、Bax、酶切Caspase-3蛋白表達量比較

2.4熟地黃調控p38MAPK對6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞增殖、凋亡相關蛋白表達影響 與對照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經細胞中Ki-67蛋白表達量顯著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經細胞中Ki-67蛋白表達量逐漸顯著升高，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達量逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經細胞中Ki-67蛋白表達量顯著降低，Bax、酶切Caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見表1，圖3。

2.5熟地黃調控p38MAPK對6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞氧化應激影響 與對照組比較，6-OHDA組多巴胺能神經細胞中SOD含量顯著降低，ROS、MDA含量顯著升高，培養液上清中LDH含量升高(P<0.05)；與6-OHDA組比較，熟地黃低、中、高劑量組多巴胺能神經細胞中SOD含量逐漸顯著升高，ROS、MDA含量逐漸顯著降低，培養液上清中LDH含量逐漸顯著降低(P<0.05)；與熟地黃高劑量組比較，熟地黃高劑量+Anisomycin組多巴胺能神經細胞中SOD含量顯著降低，ROS、MDA含量顯著升高，培養液上清中LDH含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

圖3 各組各組多巴胺能神經細胞中增殖和凋亡 相關蛋白表達

表2 各組多巴胺能神經細胞中ROS、MDA、SOD含量和培養液上清中LDH含量比較

3 討 論

帕金森病屬于神經退行性疾病，多發生于中老年人，也是中老年殘疾的重要誘因〔7〕。帕金森病常見病理變化為腦黑質致密帶多巴胺神經細胞脫落、缺失，目前尚不清楚帕金森病發生的原因，遺傳因素、興奮性因素、自身免疫因素、氧化應激、環境因素等均與其有關，其中氧化應激因素研究最多〔8,9〕。6-OHDA是常見的體外構建帕金森病細胞模型的誘導因子〔10〕。帕金森病條件下，多巴胺能神經細胞中合成大量ROS，這些ROS不能被抗氧化酶SOD等及時清除，誘導ROS聚集，而過量的ROS可促進脂質發生過氧化，生成MDA；脂質是細胞膜的重要組成部分，其過氧化后可誘導細胞膜完整性破壞，導致原本多存在于細胞內的LDH釋放至細胞外，因此檢測MDA、LDH水平可間接反映氧化應激水平〔11,12〕。過量的ROS還可以激活細胞凋亡蛋白如Bax、酶切Caspase-3，促進細胞凋亡發生〔13〕。Ki-67是細胞增殖標志蛋白，其表達變化與細胞增殖水平有關〔14〕。本實驗結果表明，6-OHDA誘導多巴胺神經細胞氧化應激，激活細胞凋亡，成功構建了體外帕金森病細胞模型。

熟地黃是常見中藥材，具有滋陰補腎的功效，現代藥理學證明熟地黃有調節免疫力、改善骨質疏松、降血糖、抗衰老、抗氧化、改善腎功能等作用〔15〕。熟地黃對神經系統有保護作用，可以抑制阿爾茨海默病大鼠海馬神經細胞損傷，減少Caspase-3活化〔16〕；熟地黃治療后的注意缺陷多動障礙大鼠神經元發育明顯改善〔17〕。熟地黃對帕金森病可能有治療功效，復方地黃處理后的帕金森病動物模型運動障礙癥狀減輕〔18〕；熟地黃處理后的MPP+誘導的神經細胞凋亡減少，Bax和酶切Caspase-3蛋白表達減少〔19〕。本實驗結果說明熟地黃能夠減輕6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞氧化應激，進而減少細胞凋亡，與以前的研究報道結果一致〔12〕，均提示熟地黃可能是帕金森病治療的有效藥物。

熟地黃作用機制與信號途徑的轉導有關〔20〕。本實驗發現，熟地黃處理可降低多巴胺能神經細胞中p38MAPK磷酸化水平，熟地黃作用機制可能與p38MAPK有關。p38MAPK是MAPK信號通路的重要分支，在細胞增殖、氧化應激、細胞凋亡、細胞衰老、炎癥、能量代謝過程中發揮作用〔21〕。有研究〔22〕表明，p38MAPK在帕金森病進展中過度激活，p38MAPK具有促進帕金森病發生的作用。p38MAPK在6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞中過度磷酸化，且抑制p38MAPK可改善多巴胺能神經細胞損傷〔23〕。本文以p38MAPK激活劑進一步驗證熟地黃的作用機制，結果發現，p38MAPK激活劑能夠逆轉熟地黃對6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞增殖、凋亡和氧化應激的作用，提示熟地黃通過抑制p38MAPK信號發揮作用。

綜上，熟地黃可能是帕金森病治療的潛在藥物，其能夠通過抑制p38MAPK信號改善6-OHDA誘導的多巴胺能神經細胞氧化應激，進而減少細胞凋亡。關于熟地黃通過何種具體靶向機制影響p38MAPK信號進而發揮作用還有待進一步研究。