干性增強(qiáng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來源的擠壓囊泡抑制多種腫瘤細(xì)胞生長

房文靜，楊夢婷，張俊堯，費(fèi)菲，李麗，陳茜，李張左，侯寒進(jìn)，龔愛華

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

近來，干細(xì)胞調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用引起廣泛的關(guān)注。干細(xì)胞可以定向遷移至腫瘤局部，抑制腫瘤細(xì)胞生長并使其向良性表型轉(zhuǎn)化，相對于傳統(tǒng)的腫瘤治療具有安全性高和不良反應(yīng)小等優(yōu)勢[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物可以誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞，具有安全性高、成本低和易操作等優(yōu)勢[3]。研究表明，β-煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)、雷帕霉素、維生素C等小分子藥物具有誘導(dǎo)或維持干細(xì)胞干性的作用[4-6]。此外，在2D培養(yǎng)中，干細(xì)胞的多種特性可能會降低甚至喪失，3D培養(yǎng)則可提供更完整的細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)相互作用的微環(huán)境。在3D培養(yǎng)中，細(xì)胞所需的多種特性得以保持甚至促進(jìn)[7]。

八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)基因主要在胚胎干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞中表達(dá)，對于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新具有重要作用，也是產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的必要因子[8]。Nanog基因主要在胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)，其與細(xì)胞分裂、分化情況以及細(xì)胞的干細(xì)胞特性密切相關(guān)[9]。干細(xì)胞通過釋放各種旁分泌因子如細(xì)胞外囊泡和可溶性物質(zhì)等發(fā)揮功能，這些因子可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[10-11]。近來研究發(fā)現(xiàn)，從間充質(zhì)干細(xì)胞上清液中提取的微囊泡在體內(nèi)外均有明顯的抗腫瘤效應(yīng)[12]。此外，經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞擠壓出的囊泡產(chǎn)出率高，且與分泌至細(xì)胞外的微囊泡具有相似的特征和功能[13]。但是，干細(xì)胞擠壓囊泡是否具有與干細(xì)胞來源的外泌體功能類似的抗腫瘤效應(yīng)尚不清楚。因此，本研究擬篩選小分子藥物NMN、甜菜堿、維生素C和雷帕霉素促進(jìn)MEF干性的最適濃度和最適組合，并將篩選出的組合與3D培養(yǎng)相結(jié)合，進(jìn)而將篩選出的干性增強(qiáng)的MEF擠壓成囊泡，探究其對腫瘤細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MEF、小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GL261細(xì)胞系、小鼠肺癌細(xì)胞Lewis和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6均由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM購自美國Hyclone公司；澳洲胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol裂解液、2×SYBR Green Mix溶液、CCK8試劑盒均購自南京諾唯贊公司；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；Matrigel膠購買自美國BD公司；兔抗人β-微管蛋白抗體購自英國Abcam公司；干性指標(biāo)相關(guān)兔抗小鼠Oct-4抗體和兔抗小鼠Nanog抗體購自美國Cell公司；NMN、雷帕霉素、甜菜堿等均購自美國MCE公司；ECL發(fā)光液購買自美國Millipore Immobilon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MEF、Lewis、Hepa1-6和GL261細(xì)胞用含谷氨酰胺、5 μg/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM，于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 篩選促進(jìn)MEF干性的小分子藥物

1.2.2.1 藥物配制及處理 用培養(yǎng)液配制1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L濃度梯度的NMN和甜菜堿，10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L濃度梯度的維生素C和雷帕霉素，另設(shè)不加藥物的培養(yǎng)基作為對照，加入MEF培養(yǎng)體系中培養(yǎng)72 h。

1.2.2.2 qRT-PCR檢測不同濃度藥物處理細(xì)胞中Oct-4mRNA相對表達(dá)量 用Trizol提取“1.2.2.1”不同濃度梯度NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C處理的MEF總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄，獨(dú)立樣本均設(shè)3個復(fù)孔并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配置10 μL反應(yīng)體系，4.1 μL DEPC水、5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ和上、下游引物各0.2 μL、0.5 μL cDNA混合均勻后加入8聯(lián)管中。95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃退火30 s，40個循環(huán)。根據(jù)NCBI查找的基因序列設(shè)計(jì)引物，Oct-4mRNA上游引物為5′-TTAAGAACATGTGTAAGCTGCG-3′，下游引物為5′-GCATATCTCCTGAAGGTTCTCA-3′。將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算Oct-4mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。篩選出NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C最適濃度。

1.2.3 篩選促進(jìn)MEF干性的小分子藥物組合

1.2.3.1 藥物分組及處理 將NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C按照篩選出的最適濃度進(jìn)行互相組合，兩兩組合為NMN+雷帕霉素、NMN+甜菜堿、NMN+維生素C、雷帕霉素+甜菜堿、雷帕霉素+維生素C、甜菜堿+維生素C；3種互相組合為NMN+甜菜堿+雷帕霉素、NMN+維生素C+雷帕霉素、NMN+甜菜堿+維生素C、甜菜堿+雷帕霉素+維生素C；4種相互組合為NMN+雷帕霉素+甜菜堿+維生素C；將不同組合分別加入MEF培養(yǎng)體系中培養(yǎng)72 h。

1.2.3.2 qRT-PCR檢測不同處理組細(xì)胞Oct-4mRNA相對表達(dá)量 采用Trizol提取“1.2.3.1”中MEF總RNA，其余操作同“1.2.2.2”。

1.2.3.3 CCK8法檢測細(xì)胞增殖 將MEF接種于96孔板，每孔接種3 000個細(xì)胞(100 μL培養(yǎng)基)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，分別加入10 μmol/L NMN、10 μmol/L雷帕霉素、10 μmol/L甜菜堿、100 μmol/L維生素C以及“1.2.3.1”所述小分子藥物組合，每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育72 h；每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育1～4 h；用酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度(D)值。細(xì)胞活性(%)=(D實(shí)驗(yàn)組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%。

1.2.4 小分子藥物聯(lián)合3D培養(yǎng)體系的建立

1.2.4.1 3D培養(yǎng)體系的建立 取處于對數(shù)生長期的MEF，胰酶消化，制備成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)5×105個細(xì)胞，加入至10 μL Matrigel基質(zhì)膠中；將與細(xì)胞混勻的基質(zhì)膠滴到預(yù)熱的24孔板中；待膠滴凝固呈凸起的穹頂狀時，每孔加入500 μL無血清條件培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4.2 藥物分組及處理 將NMN+甜菜堿、雷帕霉素+甜菜堿、甜菜堿+維生素C藥物組合分別加入至3D培養(yǎng)體系中，以未經(jīng)藥物處理的3D培養(yǎng)體系為對照，每隔一天記錄MEF生長狀態(tài)。在第6天時，顯微鏡(40×)下計(jì)數(shù)直徑大于50 μm的克隆球個數(shù)。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 制備含1% PMSF的蛋白裂解液，分別收集未經(jīng)藥物處理的2D培養(yǎng)、未經(jīng)藥物處理的3D培養(yǎng)、NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)、甜菜堿+雷帕霉素聯(lián)合3D培養(yǎng)、甜菜堿+維生素C聯(lián)合3D培養(yǎng)6 d后的MEF，加入裂解液，充分裂解后，100 ℃加熱10 min；4 ℃，12 000×g離心10 min；配制10%的SDS-PAGE分離膠，加入蛋白，80 V電泳120 min分離樣品；300 mA轉(zhuǎn)膜150 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入一抗(Oct-4抗體、Nanog抗體，均1 ∶2 000稀釋，β-微管蛋白抗體1 ∶5 000稀釋)于4 ℃孵育過夜；TBST溶液洗膜3次；37 ℃孵育二抗(1 ∶10 000稀釋)1 h；TBST溶液清洗3次；ECL發(fā)光液顯色，灰度分析軟件Image J 5.0分析圖像。

1.2.4.4 qRT-PCR檢測不同處理組細(xì)胞Oct-4mRNA相對表達(dá)量 以不加任何藥物處理的2D培養(yǎng)體系的MEF為對照組，按照“1.2.3.1”分組將藥物進(jìn)行組合，分別加入至3D培養(yǎng)體系的MEF中，培養(yǎng)72 h后提取RNA，qRT-PCR檢測不同處理組細(xì)胞Oct-4mRNA相對表達(dá)量，方法同“1.2.2.2”。

1.2.5 擠壓法收集細(xì)胞囊泡及粒徑測定

1.2.5.1 囊泡制備 取2D培養(yǎng)的MEF，胰酶消化，離心收集后計(jì)數(shù)。NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)體系與3D培養(yǎng)體系的MEF通過收集板表面凝固的膠滴到1.5 mL EP管中，在1 mL室溫解離緩沖液中(EDTA胰蛋白酶)重新懸浮顆粒，200×g離心5 min，棄上清液；加入1 mL預(yù)冷的培養(yǎng)基，4 ℃，500×g離心5 min，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。將細(xì)胞分別通過10 μm、1 μm、200 nm的聚碳酸酯膜，通過反復(fù)抽濾使其擠壓成200 nm左右的小囊泡。

1.2.5.2 囊泡分組與粒徑分析 根據(jù)囊泡來源不同，分成2D囊泡組、3D囊泡組與干性明顯增強(qiáng)的NMN+甜菜堿聯(lián)合3D囊泡組，將“1.2.5.1”細(xì)胞擠壓出的囊泡分別梯度稀釋104倍，采用32 W、50 Hz的超聲儀器超聲15 min；采用NanoZS90粒徑分析儀檢測囊泡粒徑。

1.2.6 細(xì)胞分組及擠壓囊泡處理 將Hepa1-6、Lewis、GL261和MEF接種至96孔板，每孔3 000個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜；分別以不加任何處理的Hepa1-6、Lewis、GL261和MEF為對照組，取“1.2.5”擠壓所得囊泡分別加入96孔板中(每孔加入相當(dāng)于3 000個細(xì)胞擠壓的囊泡數(shù))，同時為了防止藥物本身對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，每孔加入NMN、甜菜堿、NMN+甜菜堿，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，方法同“1.2.3.3”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度小分子藥物對MEF干性的影響

用不同濃度梯度的小分子藥物處理MEF，qRT-PCR結(jié)果顯示，相對于未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞，1 μmol/L NMN抑制Oct-4mRNA表達(dá)，10 μmol/L促進(jìn)Oct-4mRNA表達(dá)(圖1A，P<0.05)；甜菜堿在10 nmol/L和10 μmol/L時促進(jìn)Oct-4mRNA表達(dá)，且10 μmol/L時效果更明顯(圖1B，P<0.05)；維生素C在100 nmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L時促進(jìn)Oct-4mRNA表達(dá)，且100 μmol/L效果更明顯，但是1 μmol/L和1 mmol/L抑制Oct-4mRNA表達(dá)(圖1C，P<0.05)；雷帕霉素10 μmol/L和100 μmol/L促進(jìn)Oct-4mRNA表達(dá)，且10 μmol/L作用效果更明顯，1 mmol/L抑制Oct-4mRNA表達(dá)(圖1D，P<0.05)。上述結(jié)果表明，NMN、雷帕霉素和甜菜堿促進(jìn)MEF干性的最適濃度為10 μmol/L，維生素C最適濃度為100 μmol/L。

A：MEF細(xì)胞在6種濃度梯度NMN處理下Oct-4 mRNA表達(dá)量；B：MEF細(xì)胞在6種濃度梯度甜菜堿處理下Oct-4 mRNA表達(dá)量；C：MEF細(xì)胞在6種濃度梯度維生素C處理下Oct-4 mRNA表達(dá)量；D：MEF細(xì)胞在6種濃度梯度雷帕霉素處理下Oct-4 mRNA表達(dá)量；*：P<0.05，與對應(yīng)的0 nmol/L組比較

2.2 不同藥物組合對MEF干性和增殖能力的影響

qRT-PCR結(jié)果表明，兩種藥物組合中NMN+甜菜堿、雷帕霉素+甜菜堿、甜菜堿+維生素C明顯促進(jìn)Oct-4mRNA表達(dá)，且NMN+甜菜堿組相對表達(dá)最高(圖2A，P<0.05)。3種藥物組合和4種藥物組合中，與未經(jīng)藥物處理組相比，甜菜堿+雷帕霉素+維生素C組Oct-4mRNA相對表達(dá)量明顯增高，而NMN+甜菜堿+雷帕霉素組、NMN+維生素C+甜菜堿、NMN+維生素C+甜菜堿Oct-4mRNA表相對達(dá)量則明顯降低(圖2B，P<0.05)。

A:兩種藥物相互組合對MEF中Oct-4 mRNA表達(dá)的影響；B: 3種藥物和4種藥物相互組合對MEF中Oct-4 mRNA表達(dá)的影響；C: CCK8法檢測不同藥物和藥物組合處理后MEF增殖情況。*：P<0.05，與未經(jīng)藥物處理組比較

CCK8結(jié)果表明，與未經(jīng)藥物處理組相比，10 μmol/L雷帕霉素細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，兩種藥物組合中雷帕霉素+甜菜堿組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，3種藥物組合和4種藥物組合中，NMN+甜菜堿+雷帕霉素、NMN+雷帕霉素+維生素C、甜菜堿+雷帕霉素+維生素C、NMN+雷帕霉素+甜菜堿+維生素C組細(xì)胞增殖率明顯降低(圖2C，P均<0.05)。由此可見，NMN+甜菜堿組合促進(jìn)MEF干性效果最強(qiáng)，同時不抑制其增殖。

2.3 小分子藥物組合對3D培養(yǎng)體系中MEF干性的影響

MEF在不同3D培養(yǎng)體系中生長，逐漸形成不同數(shù)量的克隆球，相對于不加藥物處理的3D培養(yǎng)組，NMN+甜菜堿組聯(lián)合3D培養(yǎng)組與甜菜堿+維生素C聯(lián)合3D培養(yǎng)組克隆球數(shù)目明顯增多，其中NMN+甜菜堿組聯(lián)合3D培養(yǎng)組粒徑大于50 μm的克隆球數(shù)目最多(圖3A～B，P<0.05)。與2D培養(yǎng)組細(xì)胞相比，未經(jīng)藥物處理的3D培養(yǎng)組和小分子藥物組合聯(lián)合3D培養(yǎng)體系細(xì)胞Oct-4mRNA表達(dá)水平均明顯升高，其中3D培養(yǎng)體系中，NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)組細(xì)胞中Oct-4mRNA相對表達(dá)水平明顯高于其他組，且表達(dá)水平最高(圖3C，P<0.05)。在MEF中，NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)組Oct-4和Nanog蛋白表達(dá)量明顯高于2D培養(yǎng)組、未經(jīng)藥物處理的3D培養(yǎng)組、甜菜堿+維生素C聯(lián)合3D培養(yǎng)組、雷帕霉素+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)組(圖3D～3F，P<0.05)。上述結(jié)果表明，MEF在3D環(huán)境下生長，干性明顯增高，加入篩選出的藥物NMN+甜菜堿組合能夠進(jìn)一步提高M(jìn)EF干性。

A：MEF在3D培養(yǎng)和加藥3D培養(yǎng)條件下形態(tài)變化；B：不同藥物處理的3D培養(yǎng)體系中直徑大于50 μm的克隆球數(shù)比較；C：qRT-PCR檢測不同藥物組合和3D培養(yǎng)對MEF中Oct-4 mRNA表達(dá)量的影響；D：蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測MEF中Oct-4和Nanog蛋白表達(dá)；E：Nanog蛋白相對表達(dá)量灰度分析圖；F：Oct-4蛋白相對表達(dá)量灰度分析圖。*：P<0.05，與未經(jīng)藥物處理組比較；△:P<0.05,與2D培養(yǎng)組比較；#：P<0.05，與未經(jīng)藥物處理的3D培養(yǎng)組比較

2.4 擠壓法獲得MEF囊泡的表征

將促進(jìn)細(xì)胞干性最強(qiáng)的組合NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)體系細(xì)胞、3D培養(yǎng)體系細(xì)胞和2D培養(yǎng)體系細(xì)胞擠壓成囊泡，粒徑分析結(jié)果顯示，2D培養(yǎng)體系細(xì)胞囊泡平均粒徑為208 nm(圖4A)，3D培養(yǎng)體系細(xì)胞囊泡平均粒徑為213 nm(圖4B)，NMN+甜菜堿組3D培養(yǎng)體系細(xì)胞囊泡平均粒徑為193 nm(圖4C)。由此可見，細(xì)胞已經(jīng)被擠壓成了200 nm左右的囊泡。

A：2D培養(yǎng)體系擠壓囊泡粒徑分布；B：3D培養(yǎng)體系擠壓囊泡粒徑分布；C：NMN+甜菜堿組3D培養(yǎng)體系擠壓囊泡粒徑分布

2.5 干性增強(qiáng)的MEF擠壓囊泡抑制多種腫瘤細(xì)胞生長

CCK8結(jié)果表明，與對照組相比，3D囊泡組、NMN+甜菜堿聯(lián)合3D囊泡組Hepa1-6、Lewis和GL261細(xì)胞增殖率明顯降低(P均<0.05)；與3D囊泡組相比，NMN+甜菜堿聯(lián)合3D囊泡組Lewis和GL261細(xì)胞增殖率明顯降低(P均<0.05)；與對照組相比，2D囊泡組、3D囊泡組與NMN+甜菜堿聯(lián)合3D囊泡組對MEF增殖沒有明顯影響(圖5A)。將NMN+甜菜堿單獨(dú)加入4種細(xì)胞中，CCK8結(jié)果顯示，與未加藥處理的對照組相比，加入NMN和甜菜堿的MEF、Lewis、Hepa1-6和GL261細(xì)胞增殖無明顯差異(圖5B)。由此可見，小分子藥物聯(lián)合3D培養(yǎng)導(dǎo)致干性增強(qiáng)的MEF擠壓囊泡能夠特異性地抑制Hepa1-6、Lewis和GL261腫瘤細(xì)胞生長。

A：CCK8檢測2D、3D和加藥3D組細(xì)胞擠壓囊泡對不同腫瘤細(xì)胞和MEF生長的影響；B：CCK8檢測NMN和甜菜堿對腫瘤細(xì)胞和MEF生長的影響。*：P<0.05，與對照組相比；#：P<0.05，與3D囊泡組相比

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的基因重編程的方式誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，提供更加簡單和安全有效的方式來重新賦予成體細(xì)胞“多潛能性”[14-15]。本研究選取NMN、甜菜堿、維生素C和雷帕霉素4種具有促進(jìn)細(xì)胞干性潛力的小分子藥物作用于MEF，通過干性指標(biāo)Oct-4mRNA水平的變化挑選出最適作用濃度。為提高小分子藥物的作用效果，將幾種小分子藥物在最適濃度條件下組合，同時為防止藥物組合影響細(xì)胞生長的狀態(tài)，通過CCK8分析細(xì)胞的增殖情況，篩選出既能促進(jìn)細(xì)胞干性，又能維持細(xì)胞生長的小分子藥物組合，即NMN+甜菜堿。

Nanog和Oct-4是有助于胚胎干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子，在胚胎干細(xì)胞的全能性維持中起關(guān)鍵作用，在未分化的胚胎干細(xì)胞中表達(dá)量較高[16-17]。3D培養(yǎng)比傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)更好地模擬了干細(xì)胞所處的微環(huán)境，能夠維持干細(xì)胞干性[18]。本研究通過比較Nanog和Oct-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與2D培養(yǎng)體系相比，在3D培養(yǎng)條件下MEF干性顯著增強(qiáng)，NMN+甜菜堿在3D培養(yǎng)的基礎(chǔ)上能夠進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞干性。

早期研究表明，干細(xì)胞來源的外泌體具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的潛力，但是外泌體的提取過程比較繁瑣并且產(chǎn)量低[19]。研究表明，通過擠壓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以產(chǎn)生大量的納米囊泡，其產(chǎn)量是外泌體的20倍，并且間充質(zhì)干細(xì)胞擠壓的囊泡具有心肌保護(hù)作用和治療潛力，類似于從相同的細(xì)胞中提取的細(xì)胞外囊泡[13]。本研究通過3D培養(yǎng)和小分子藥物組合獲得干性增強(qiáng)的細(xì)胞，擠壓法制備成囊泡作用于Hepa1-6、Lewis、GL261等3種腫瘤細(xì)胞和MEF，結(jié)果顯示，與2D培養(yǎng)體系細(xì)胞擠壓囊泡相比，3D培養(yǎng)體系細(xì)胞的擠壓囊泡能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖而不影響MEF增殖，而干性更強(qiáng)的NMN+甜菜堿聯(lián)合3D培養(yǎng)組MEF囊泡抑制效果更強(qiáng)。由此表明，干性增強(qiáng)的細(xì)胞囊泡能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，具有廣譜性，并且對不同腫瘤細(xì)胞抑制效果不同，其具體機(jī)制尚未可知，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NMN+甜菜堿與細(xì)胞的3D培養(yǎng)相結(jié)合能夠提高M(jìn)EF的干性，同時不抑制MEF的生長。干性提高后的MEF擠壓囊泡對腫瘤細(xì)胞的生長有一定抑制作用。