人臍帶間質干細胞來源的外泌體抑制肝竇內皮細胞毛細血管樣改變

王晨， 王巖金， 楊馥吉， 嚴永敏， 譚友文

(1. 江蘇大學附屬鎮江三院肝病科，江蘇 鎮江 212005； 2. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

據統計，全球有超過13億的肝病患者，其中我國為4億多[1]。慢性肝病是肝病的常見形式之一，其向肝纖維化進展的病理基礎之一是肝竇毛細血管化。肝竇毛細血管化是早期肝纖維化治療的重要靶點，但目前尚缺乏理想的干預手段[2]。肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)是肝臟中占比最高的非實質性細胞，也是肝竇毛細血管化的效應細胞。LSEC通過內吞循環血液中的有毒物質參與肝臟免疫耐受，保護肝臟抵御外界損傷[3]。抑制LSEC的毛細血管樣改變是靶向肝竇毛細血管化治療慢性肝病的重要內容。

間質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種來源于中胚層并廣泛分布于全身各組織中的干細胞，具有高度的多向分化能力和自我更新能力。外泌體是一種由細胞內多胞體與胞膜融合后分泌到細胞外環境中的非可溶性膜性囊泡(30～100 nm)。外泌體攜帶其來源細胞的遺傳信息(蛋白或mRNA、miRNA)，通過受體結合、胞吞、胞膜融合等方式進入靶細胞，是細胞間遺傳信息傳遞的載體[4]。不同細胞來源的外泌體組成不同，因此具有較復雜的生物學功能。許多類型的MSC以及MSC來源的外泌體(MSC derived exosomes, MSC-Ex)在組織損傷修復、免疫調節等方面發揮著重要作用[5-7]。近年來，MSC-Ex在肝病治療領域引起了廣泛關注[8]，但其能否抑制肝竇毛細血管化尚不清楚。本研究擬觀察人臍帶MSC-Ex對LSEC毛細血管樣改變的影響，以及對肝纖維化組織膠原沉積及促血管生成素-2(angiopietin-2, Ang-2)蛋白表達的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及主要儀器

雌性ICR小鼠，6～8周齡，15只，體質量(26±2) g，購買并飼養于江蘇大學實驗動物中心， 合格證號UJS-IACUC-AP-2020033127。飼養條件：溫度20～25 ℃，濕度45%～55%，通風良好，提供充足的飲食。各項實驗方案均符合江蘇大學動物實驗中心倫理審查標準。

內皮細胞完全培養液(浙江明州生物有限公司)；TNF-α、0.25% EDTA胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(澳大利亞Bovogen公司)；DMSO(滬試公司)；青霉素-鏈霉素雙抗和引物(美國Invitrogen公司)；兔抗人CD9(美國Proteintech公司)；兔抗人β-肌動蛋白、CD34、Ang-2抗體(美國Bioworld公司)；兔抗人CD63、TSG101、Calnexin，小鼠抗人Alix(英國Abcam公司)；HRP標記的羊抗兔/小鼠二抗，BCA蛋白測定試劑盒(北京康為世紀公司)；RIPA/PMSF裂解液、逆轉錄試劑盒(中國Vazyme公司)；蛋白預染Marker(MBI公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；SABC免疫組織化學試劑和DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；曝光液(德國Millipore公司)；96孔板(美國Cellster公司)；25 cm2細胞培養瓶(美國Fisher公司)；凍存管(美國Axygen公司)；封口膜(法國Pechiney公司)；截留分子量100 kD超濾離心管(中國MBI公司)。NanoDrop 1000核酸蛋白濃度檢測儀(美國Thermo公司)；蛋白電泳儀和電泳槽(美國Bio-Rad公司)；ABI熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；化學發光凝膠成像儀(日本GE公司)；納米顆粒跟蹤分析儀(英國Malvern公司)；數字切片掃描儀(匈牙利3D Histech公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細胞實驗

1.2.1 MSC分離培養 分離培養MSC所需臍帶取自鎮江市第四人民醫院，涉及所有實驗程序均符合江蘇大學倫理委員會(2012258)批準。將無菌操作的臍帶剪成約4 mm3組織塊，貼壁培養在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的α-MEM中，并放置于含5% CO2的37 ℃培養箱內。待細胞貼壁密度大于50%時更換營養液。該營養液中添加的胎牛血清預先在4 ℃行10 000 ×g超速離心16 h，以去除胎牛本身含有的外泌體。繼續培養至細胞貼滿板底，消化傳代，每次消化前收集培養上清液，于-80 ℃保存。

1.2.2 LSEC培養 以含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗和1%的內皮細胞培養添加劑的原代內皮細胞完全培養液培養LSEC，并放置于含5% CO2的37 ℃培養箱內，每2～3 d傳代1次，實驗所用LSEC均生長狀態良好。

1.2.3 MSC-Ex提取和鑒定 將MSC培養過程收集的細胞上清液通過2 000 ×g離心去除大細胞碎片、小細胞碎片以及細胞器。裝入100 kD的超濾管以3 500×g離心30 min，重復多次至液體黏稠；4 ℃，100 000×g離心60 min以沉淀外泌體；棄上清液，加入適量PBS溶解過夜；將溶解得到的MSC-Ex通過0.22 μm濾菌器滅菌，分裝于數小支Ep管，于-80 ℃保存。采用透射電鏡觀察MSC-Ex形態，采用納米顆粒跟蹤分析儀確定MSC-Ex粒徑分布和相對顆粒數，采用BCA蛋白檢測試劑盒對MSC-Ex進行蛋白濃度分析，蛋白質免疫印跡檢測外泌體標志物表達。

1.2.4 LSEC毛細血管化模型構建 將第1～3代生長狀態良好的LSEC以2×105個/孔細胞密度接種于6孔板內。參考文獻[9-10]進行預實驗，顯示100 ng/mL、200 ng/mL TNF-α對LSEC有較好的誘導效果。依據不同濃度的TNF-α將細胞分為0、100、200 ng/mL TNF-α組。待細胞貼壁后，用原代內皮細胞完全培養液稀釋初始濃度為100 ng/μL TNF-α，使得6孔板各孔中TNF-α終濃度分別為0、100、200 ng/mL，并置于含5% CO2的37 ℃孵箱內繼續培養至24 h。在MSC-Ex治療實驗中，根據TNF-α及MSC-Ex濃度的不同，分為對照組、200 ng/mL TNF-α組、200 ng/mL TNF-α+200 μg/mL MSC-Ex組和200 ng/mL TNF-α+400 μg/mL MSC-Ex組，繼續培養24 h以上。

1.2.5 外泌體攝取實驗 實驗前一天將LSEC以2×105個/孔細胞密度種于6孔板。實驗當天將40 μL外泌體(約1.5×1010/mL)與2 μL DIO染料混合，靜置20 min；加入適量PBS，以3 000×g，4 ℃離心30 min洗滌未結合的染料；將DIO標記的外泌體均勻加入預先鋪有LSEC的6孔板內，于5% CO2，37 ℃孵育8 h以上，熒光顯微鏡下觀察外泌體攝取情況。

1.2.6 蛋白質免疫印跡檢測外泌體標志物及LSEC中Ang-2、CD34蛋白表達 采用BCA蛋白測定試劑盒測定每個樣品蛋白濃度。按照目的分子量大小配置不同濃度SDS-PAGE分離膠。蛋白質樣品行SDS-PAGE(60 V電泳30 min，接著80 V電泳120 min)，然后電轉至硝酸纖維素膜(300 mA電轉120 min)；用含5%脫脂奶粉的TBST孵育1 h；加入兔抗人β-肌動蛋白(1 ∶2 000)、小鼠抗人Alix(1 ∶400)、兔抗人Calnexin、兔抗人TSG101、兔抗人CD63、兔抗人CD9，均1 ∶500稀釋；兔抗人Ang-2、兔抗人CD34，均1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；TBST清洗；加入HRP標記的羊抗小鼠或羊抗兔二抗(1 ∶2 000)于37 ℃孵育1 h；TBST清洗；用Bio-Rad成像系統曝光顯影，用Image J軟件對條帶進行灰度值分析。

1.2.7 RNA提取和qRT-PCR檢測LSEC中Ang-2、CD34 mRNA相對表達量 Trizol法提取LSEC總RNA，采用NanoDrop 1 000核酸蛋白濃度檢測儀檢測總RNA濃度和純度后，按照逆轉錄操作程序將提取的RNA逆轉錄為cDNA，按照試劑盒說明書配置好20 μL反應體系：SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板2 μL，DEPC水7 μL。qRT-PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火1 min(Ang-2: 58 ℃，CD34: 63 ℃)，72 ℃延伸30 s，共計40個循環。β-肌動蛋白為內參，獨立樣本均設3個復孔，統計各組2-ΔΔCt，比較mRNA相對表達。引物序列由美國Invitrogen公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.2.8 小管形成實驗 預先在冰冷96孔板鋪上100 μL基質膠(10 mg/mL)，于37 ℃靜置至少30 min使基質膠凝固。使用去除生長因子的原代內皮細胞完全培養液將“1.2.4”中不同組別的LSEC以3×104個細胞(100 μL)/孔接種在96孔板內，標記好組別，在5% CO2，37 ℃孵箱中培養。預實驗發現2 h后出現成管現象，6 h成管結束，故每間隔1 h在倒置顯微鏡下觀察LSEC的管腔形成能力，并進行拍攝。選取某一具有代表性的時間點，采用Image J軟件分析管腔形成情況。

1.3 動物實驗

1.3.1 肝纖維化模型構建 采用蛋氨酸、膽堿缺乏飼料(methionine and choline deficiency diet，MCD)喂養小鼠8周制備肝纖維化模型[11]。將小鼠隨機分為3組：對照組組、MCD組、MSC-Ex組，每組5只。將250 μg MSC-Ex溶于100 μL PBS，通過尾靜脈分別注射MSC-Ex(10 mg/kg)和100 μL PBS,每3 d注射1次，共注射5次。末次注射后1 d注射適量戊巴比妥對小鼠實施安樂死并收集各組小鼠肝臟組織，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切成4～6 μm薄片。

1.3.2 天狼猩紅染色檢測小鼠肝臟組織膠原沉積 肝組織切片常規脫水脫蠟；天狼猩紅染色液滴染1 h，流水沖洗10 min去除切片表面染液；滴加蘇木素染色液染細胞核8～10 min，流水沖洗10 min；脫水透明，用中性樹脂封固并在顯微鏡下觀察。用Image J軟件分析小鼠肝臟組織中膠原沉積陽性面積百分率。

1.3.3 免疫組織化學檢測小鼠肝臟組織中Ang-2蛋白表達 取小鼠肝臟組織石蠟切片于60 ℃烘箱中烘干6～8 h；切片依次置于二甲苯(15 min)、二甲苯(15 min)、100%乙醇(2 min)、100%乙醇(2 min)、95%乙醇(1 min)、95%乙醇(1 min)、80%乙醇(1 min)、70%乙醇(1 min)；PBS洗3次，每次5 min；將切片浸泡于高溫檸檬酸鹽緩沖液30 min以修復抗原；3%過氧化氫孵育30 min以抑制內源性過氧化物酶活性；5%牛血清白蛋白封閉1 h；加入Ang-2(1 ∶200)一抗孵育過夜，陰性對照以PBS代替Ang-2抗體進行孵育；次日，各組加入生物素化二抗室溫孵育30 min；SABC試劑于37 ℃孵育30 min；滴加DAB顯色液；蘇木精復染，并控制每組顯色時間相同；脫蠟，水化，中性樹脂封片，于自動掃片機下觀察，進行切片圖像采集。用Image J軟件分析小鼠肝臟組織中目的蛋白Ang-2的陽性面積百分率。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 MSC-Ex鑒定

結果顯示，MSC高表達Alix、Calnexin、TSG101、CD63、CD9，MSC-Ex高表達Alix、TSG101、CD63、CD9，而去MSC-Ex上清液中外泌體標志物表達陰性。透射電鏡顯示MSC-Ex呈典型的盤狀囊泡。納米顆粒跟蹤分析儀檢測結果顯示，MSC-Ex平均直徑為110 nm左右，提取獲得的MSC-Ex顆粒濃度約為3.4×1011/mL。由此提示MSC-Ex提取成功。見圖1。

A：蛋白質免疫印跡檢測外泌體標志物表達；B：透射電鏡檢測MSC-Ex結構；C：納米顆粒分析儀檢測MSC-Ex粒徑分布及濃度

2.2 TNF-α體外誘導LSEC中Ang-2、CD34的mRNA和蛋白表達

qRT-PCR結果顯示，與0 ng/mL組相比，100 ng/mL和200 ng/mL TNF-α組Ang-2 mRNA、CD34 mRNA相對表達水平明顯升高(P均<0.05)。與100 ng/mL TNF-α相比，200 ng/mL TNF-α組的Ang-2 mRNA相對表達水平明顯升高(t=26.92，P<0.05)，CD34 mRNA差異無統計學意義。

蛋白質免疫印跡結果顯示，與0 ng/mL組相比，100 ng/mL和200 ng/mL TNF-α組Ang-2、CD34蛋白表達明顯增加(P均<0.05)。100 ng/mL和200 ng/mL TNF-α組間Ang-2和CD34蛋白表達差異無統計學意義。由此提示，TNF-α可成功誘導LSEC毛細血管樣改變。結合上述結果，選擇200 ng/mL TNF-α作為誘導LSEC毛細血管樣改變的合適濃度。見圖2。

A：qRT-PCR檢測LSEC中Ang-2、CD34 mRNA表達；B：蛋白質免疫印跡檢測LSEC中Ang-2、CD34蛋白表達

2.3 TNF-α體外誘導LSEC管腔形成

結果表明，成管4 h時，各組開始出現較明顯的成管現象，因此選擇4 h作為成管試驗的觀察時間節點。與0 ng/mL TNF-α組相比，100、200 ng/mL TNF-α組管分支數、網眼數、結點數顯著增加(P均<0.01)。與100 ng/mL TNF-α組相比，200 ng/mL TNF-α組管腔分支數、網眼數、結點數明顯增加(P均<0.01)。由此提示，TNF-α可成功誘導LSEC體外管腔形成，并且選擇200 ng/mL TNF-α作為誘導LSEC體外管形成的合適濃度。見圖3。

A:倒置顯微鏡下觀察LSEC管腔形成能力；B：成管4 h時小管形成能力的相對定量分析

2.4 MSC-Ex體外抑制LSEC中Ang-2、CD34 mRNA表達

結果顯示，MSC-Ex與LSEC共培養8 h后可被LSEC攝取，MSC-Ex定位于LSEC胞質和胞核周圍，如圖4A中箭頭所示。qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，200 ng/mL TNF-α組Ang-2和CD34 mRNA表達明顯上升(P均<0.01)。相較于200 ng/mL TNF-α組，200 ng/mL TNF-α+200 μg/mL MSC-Ex組和200 ng/mL TNF-α+400 μg/mL MSC-Ex組Ang-2、CD34 mRNA表達顯著降低(P<0.01或<0.05)。而與200 ng/mL TNF-α+200 μg/mL MSC-Ex組相比，200 ng/mL TNF-α+400 μg/mL MSC-Ex組Ang-2以及CD34 mRNA表達無顯著差異。見圖4。

A：紅色熒光染料DIO顯示MSC-Ex在LSEC內定位；B：qRT-PCR檢測LSEC中Ang-2、CD34 mRNA表達

2.5 MSC-Ex抑制LSEC管腔形成

結果表明，成管4 h時各組出現明顯成管現象，因此選擇4 h作為觀察統計的時間節點。相較于對照組，200 ng/mL TNF-α顯著促進LSEC管腔形成，管的分支數、網眼數、結點數均明顯增加(P均<0.01)，這與“2.3”的結果一致。相較于200 ng/mL TNF-α組，200 ng/mL TNF-α+200 μg/mL MSC-Ex組和200 ng/mL TNF-α+400 μg/mL MSC-Ex組4 h管腔形成的分支數、網眼數以及結點數明顯下降(P均<0.01)。與200 μg/mL MSC-Ex組相比，400 μg/mL MSC-Ex對TNF-α誘導的LSEC管形成的分支數以及結點數的抑制作用更明顯(P均<0.05)，LSEC網眼數無顯著差異。由此提示MSC-Ex可顯著抑制TNF-α誘導的LSEC體外管腔形成。見圖5。

A:倒置顯微鏡下觀察LSEC管腔形成能力；B：成管4 h時小管形成能力的相對定量分析

2.6 MSC-Ex抑制肝纖維化組織膠原沉積及Ang-2的蛋白表達

天狼猩紅染色結果顯示，與對照組相比，MCD組肝組織內膠原大量沉積于膽管周圍(t=5.87，P<0.01)，肝小葉結構不規則，出現少量點、灶狀壞死。相較于MCD組，MSC-Ex組肝組織內膠原沉積緩解，肝小葉結構變清晰(t=4.33，P<0.05)，如圖6A箭頭所示。免疫組織化學染色結果顯示，相較于對照組，MCD飲食8周可造成小鼠肝組織Ang-2蛋白表達增加(t=4.86，P<0.05)。相較于MCD組，MSC-Ex組小鼠肝組織表達Ang-2蛋白降低(t=4.30，P<0.01)，如圖6B箭頭所示。由此提示，MSC-Ex可緩解MCD飲食誘導的肝纖維化組織膠原形成，抑制促血管形成因子Ang-2的蛋白表達。

A：肝組織的天狼猩紅染色及膠原沉積陽性面積定量分析；B：免疫組織化學染色檢測肝組織的Ang-2蛋白表達及Ang-2陽性面積定量分析圖6 天狼猩紅染色和免疫組織化學染色分別檢測肝組織膠原沉積和Ang-2蛋白表達(n=3)

3 討論

LSEC毛細血管化是肝纖維化過程中的重要病理改變，可促肝臟纖維化[12]。既往關于MSC-Ex在肝纖維化中的研究主要聚焦于抑制星狀細胞膠原合成[13]、抗氧化[14]、抑制肝細胞凋亡[15]等方面。本研究發現，MSC-Ex可在體外抑制LSEC毛細血管樣改變，在體內抑制纖維化肝組織的膠原沉積和Ang-2蛋白表達，這可能是抑制肝纖維化的新研究方向。

多種因素可以影響LSEC的毛細血管樣改變，如酒精[16]、脂毒性[17]以及藥物[18]等慢性理化刺激。研究發現，TNF-α是一種可以作用于內皮細胞的多向促炎性細胞因子[19]，可促進人臍靜脈內皮細胞管形成，促進人臍靜脈內皮細胞表達血管細胞黏附分子-1[20]。生理狀態下LSEC可自分泌TNF-α參與血管內皮的炎癥反應，調節機體的免疫應答，影響血管內皮細胞微環境的穩定。本研究表明，TNF-α可體外誘導LSEC血管化指標Ang-2和CD34的mRNA及蛋白表達，誘導LSEC管腔形成。CD34在靜息內皮細胞中表達較低，但在活化的內皮細胞和循環內皮祖細胞中表達較高[21]，本研究結果與其一致，但不同濃度TNF-α誘導LSEC表達CD34 mRNA和蛋白沒有顯著差異，可能是由于100 ng/mL TNF-α已經足以誘導LSEC表達CD34 mRNA和蛋白，因此與更高濃度200 ng/mL TNF-α的差異并不大。而相較于100 ng/mL TNF-α，200 ng/mL TNF-α體外誘導LSEC表達Ang-2 mRNA和蛋白的能力更強，誘導LSEC管形成的能力也優于100 ng/mL TNF-α，呈一定的濃度依賴性。研究發現，外泌體可以作為一種血管生成抑制劑，如人臍帶MSC-Ex通過抑制素βA基因抑制胃癌的血管生成和轉移[22]，或通過激活免疫細胞和免疫細胞因子抑制腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤血管生成[23]。在既往體內外研究中，已經證實本研究所使用的MSC-Ex劑量安全無毒性，未引起小鼠不良反應[24]。本研究結果表明MSC-Ex抗LSEC毛細血管樣改變，在體外可以抑制TNF-α誘導的管形成，抑制LSEC血管化指標表達。

研究顯示，Ang-2增加血管內皮通透性[25]，誘導血管重塑[26]，是一種有效的血管新生調節因子。研究顯示，抗Ang-2治療在體內外均顯示出對肝細胞癌血管生成和腫瘤生長的顯著抑制作用[27]，并且可以通過增強Akt通路抑制血管瘤內皮細胞的增殖并誘導其凋亡[28]。也有研究顯示，Ang-2促進肝臟病理性血管生成，抗Ang-2治療可以緩解非酒精性脂肪肝的血管生成，是小鼠非酒精性脂肪肝疾病的治療靶標[29]。在慢性肝病的發展過程中，LSEC毛細血管化先于肝纖維化，抑制肝竇毛細血管化可以抑制肝星狀細胞活化，改善肝纖維化的進展[30]。在MCD飲食誘導的小鼠早期肝纖維化模型中，MSC-Ex發揮抗LSEC毛細血管化相關抗纖維化作用，而MSC-Ex治療與LSEC的Ang-2蛋白水平降低有關，推測Ang-2可能是外泌體調控LSEC血管生成的重要靶點，進一步過表達或敲減Ang-2基因可以驗證其發揮的調控作用。目前的研究結果也可能適用于其他器官，如肺或腎的血管化。此外，外泌體作為一個天然藥物載體，是否可以攜帶一些抗Ang-2藥物來聯合治療，尚需要進一步證實。

本研究結果顯示，MSC-Ex可體外抑制TNF-α誘導的LSEC Ang-2、血管內皮細胞標志CD34表達和管腔形成，降低小鼠肝纖維化組織膠原沉積及Ang-2蛋白表達，初步表明MSC-Ex可抑制LSEC的毛細血管樣改變，而MSC-Ex中發揮關鍵作用的活性因子有待進一步研究。