lncRNA HULC在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達及意義

冀 葉，袁小筍， 張 蕾， 馬慧利， 薛永飛， 李長生， 張敬偉， 任中海， 張騰飛

（1. 南陽市中心醫院腫瘤內科二病區，河南 南陽 473000；2. 鄭州大學第一附屬醫院腫瘤一病區，河南 鄭州 450001）

甲狀腺癌是內分泌系統常見的惡性腫瘤，好發于女性，近年來發病率呈不斷上升趨勢[1]。乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占全部甲狀腺癌的80%～90%[2]。多數PTC患者預后良好[3]，但由于PTC起病隱匿、早期易轉移，且復發率較高，導致仍有部分患者預后不良，甚至死亡[4]。因此，深入探討PTC的發病機制，尋找與其轉移、復發相關的敏感基因，對患者早期診療及預后改善意義重大。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度在200 nt以上的RNA，可通過多種途徑參與調控惡性腫瘤發生、進展過程[5]。肝癌高表達轉錄本（highly up-regulated in liver cancer，HULC）是新近發現的1種lncRNA，在肝細胞肝癌[6]、結直腸癌[7]、彌漫性大B細胞淋巴瘤[8]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達，在腫瘤細胞侵襲、轉移中發揮關鍵性作用。目前，關于HULC與PTC的研究較少。為此，本研究擬分析PTC組織中HULC的表達及其與臨床病理特征的相關性，并通過干擾人PTC細胞株TPC-1中HULC的表達，探討其對細胞增殖、侵襲的影響，以期為PTC的致病機制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年12月在南陽市中心醫院行手術治療的PTC患者105例，其中男31例、女74例，年齡21～72歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期68例、Ⅲ～Ⅳ期37例；發生淋巴結轉移39例。術中留取PTC組織及距離腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織（經病理學檢查排除癌變可能），快速置于液氮中冷凍，-70 ℃保存。納入標準：（1）初次手術，且經病理學檢查確診為PTC；（2）術前未接受任何治療；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他系統惡性腫瘤患者；（2）繼發性或轉移性甲狀腺癌患者；（3）合并其他甲狀腺疾病患者；（4）妊娠或哺乳期女性。本研究經南陽市中心醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Trizol試劑和Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和擴增試劑購自日本TaKaRa公司。HULC和內參引物由上海百力格生物技術有限公司設計合成。TPC-1細胞購自上海通派生物科技有限公司。RPMI-1640培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素均購自美國Hyclone公司。HULC抑制序列及對照序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司，基質膠購自美國BD公司。StepOne實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），UV1902PC紫外分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司），Stat Fax-2100酶標儀（北京天翔飛域科技有限公司）。

1.2.2 癌組織和癌旁組織中HULC表達的檢測 取癌組織和癌旁組織，剪碎、研磨，加入細胞裂解液，按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用UV1902PC紫外分光光度計檢測純度，以A260nm/A280nm比值>1.80為符合要求。根據逆轉錄試劑盒說明書要求，將總RNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），并以其為模板，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測HULC的表達，以GAPDH為內參。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，38個循環。引物序列：HULC上游引物為5'-ACCTCCAGAACTGTGATCCAAAATG-3'，下游引物為 5'-GCCAGGAAACTTCTTGCTT G A-3'；G A P D H上游引物為5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，下游引物為5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。采用2-ΔΔCt法計算癌組織和癌旁組織中HULC的相對表達量。

1.2.3 細胞培養及處理 采用含10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養液，在5% CO2、37 ℃條件下進行TPC-1細胞培養。培養24 h后，采用胰蛋白酶消化，傳代培養。收集對數生長期的細胞，消化后按2.5×105個/孔接種于6孔板，待細胞融合度達到80%以上時，使用Lipofectamine 2000試劑進行轉染。按轉染序列分為si-HULC組（轉染HULC的小分子干擾序列5'-AACCTCCAGAACTGTGATCCA-3'）、si-Con組（轉染陰性對照序列5'-CGAGCAGAGACTCTAACATTCTCGC-3'）、空白組（不作任何處理）。處理后繼續培養48 h。

1.2.4 TPC-1細胞中HULC相對表達量的檢測 將si-HULC組、si-Con組和空白組細胞進行處理后繼續培養48 h，再用胰蛋白酶消化，置于細胞裂解液中，采用RT-qPCR檢測HULC的表達情況。操作步驟同癌組織和癌旁組織中HULC表達的檢測。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取si-HULC組、si-Con組和空白組細胞，用胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，接種于96孔板，密度為2.5×105個/孔，繼續培養至細胞貼壁。分別在培養12、24、48、72和96 h時加入10 μL CCK-8，避光孵育3 h，檢測各孔A450nm值。

1.2.6 TPC-1細胞侵襲能力檢測 取si-HULC組、si-Con組、空白組細胞，用胰蛋白酶消化，離心留取沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次，用無血清RPMI-1640培養液制備細胞懸液，密度為2.5×104個/mL，備用。取基質膠，提前24 h融化，用無血清培養液進行稀釋后，平鋪在Transwell小室的上室，風干備用。取制備的細胞懸液200 μL，加入Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液600 μL，常規培養24 h，取出Transwell小室，PBS沖洗，甲醛固定，結晶紫染色，擦除散落的細胞，在倒置顯微鏡下隨機取6個高倍鏡視野對穿膜細胞進行計數，取均值。

1.3 統計學方法

所有實驗均重復3次。采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC組織與癌旁組織中HULC相對表達量的比較

PTC組織中HULC的相對表達量為2.51±0.19，顯著高于癌旁組織（1.02±0.07）（t=73.776，P<0.001）。

2.2 不同臨床病理特征的PTC患者癌組織中HULC相對表達量的比較

腫瘤直徑>2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移的PTC患者的癌組織HULC相對表達量分別顯著高于腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移PTC患者（P<0.05），而不同年齡、性別、病灶數量和局部侵犯類型PTC患者間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征的PTC患者癌組織中HULC相對表達量比較

2.3 si-HULC組、si-Con組和空白組HULC相對表達量的比較

si-HULC組、si-Con組和空白組HULC相對表達量分別為0.17±0.05、1.02±0.05和1.00±0.10，3組之間差異有統計學意義（F=293.672，P<0.001）。兩兩比較，si-HULC組HULC相對表達量低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 si-HULC組、si-Con組及空白組細胞增殖活性比較

si-HULC組培養24、48、72和96 h時A值均低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 si-HULC組、si-Con組、空白組培養不同時間的細胞增殖活性A值比較

2.5 si-HULC組、si-Con組及空白組細胞侵襲能力比較

si-HULC組、si-Con組和空白組侵襲細胞數分別為（84±8）個、（101±7）個和（103±7）個，3組之間差異有統計學意義（F=11.447，P=0.001）。si-HULC組侵襲細胞數低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 si-HULC組、si-Con組、空白組細胞侵襲情況（×200）

3 討論

有研究結果顯示，部分淋巴結轉移伴局部侵犯的PTC患者會發生治療耐受[9]。因此，開展對PTC發病機制及與腫瘤轉移相關機制或敏感基因的研究具有重要的臨床價值，可以為PTC的診療提供新的靶標。

HULC是一種高度保守的，長度為500 nt的lncRNA，位于人染色體6p24.3，在多種惡性腫瘤組織中呈特異性高表達[10]，且與腫瘤侵襲、轉移[11]及患者臨床結局[12]密切相關，下調該基因表達可促進化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，PTC組織中HULC的相對表達量顯著高于癌旁組織（P<0.001），提示HULC在PTC組織中呈高表達，可能參與了PTC的發生。本研究結果還顯示，腫瘤直徑>2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移的PTC患者的癌組織中HULC相對表達量明顯升高，進一步說明HULC可能參與了PTC的發生、發展，可能在促進腫瘤生長及淋巴結轉移中發揮重要作用。

為進一步探討HULC在PTC發生及進展中的作用，本研究采用小分子干擾RNA技術特異性沉默TPC-1細胞中HULC的表達，結果顯示，si-HULC組HULC相對表達量低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明轉染HULC干擾序列后，si-HULC組TPC-1細胞中的HULC表達被抑制。有研究結果顯示，HULC在腫瘤細胞惡性增殖過程中發揮關鍵性作用[14]。本研究結果顯示，si-HULC組培養24、48、72和96 h時的A值均低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明在抑制了HULC的表達后，TPC-1細胞的增殖活性明顯降低，提示HULC可能參與了TPC-1細胞的增殖過程。蘇文等[15]的研究結果顯示，HULC可增強口腔鱗癌細胞的侵襲能力。本研究結果顯示，si-HULC組侵襲細胞數低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明抑制HULC的表達后，TPC-1細胞的侵襲能力被抑制，提示HULC可能參與了腫瘤細胞侵襲過程。

綜上所述，PTC組織中HULC表達量升高，且與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移有關。干擾HULC表達后可抑制TPC-1細胞的增殖活性和侵襲能力。因此，HULC有望為PTC機制研究及治療靶點選擇提供新的目標基因，但其具體作用機制有待進一步研究。