PCR結(jié)合熔解曲線在高血壓藥物相關(guān)基因突變檢測中的應(yīng)用

萬長春， 楊 輝， 莊學(xué)偉

（1.金湖縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 金湖 211600；2.中日友好醫(yī)院檢驗科，北京 100029；3.山東省立第三醫(yī)院檢驗科，山東 濟南 250000）

有統(tǒng)計結(jié)果顯示，2015年，18周歲及以上人群高血壓的知曉率、治療率和控制率分別為51.6%、45.8%和16.8%[1]。血壓的有效控制可降低35%～40%的腦卒中風(fēng)險、20%～25%的心肌梗死風(fēng)險、50%以上的心力衰竭風(fēng)險[2]。在未來20年，預(yù)計全球高血壓患者將達到15億[3]。預(yù)防和控制高血壓，是遏制我國心腦血管疾病發(fā)生的核心策略。藥物治療是高血壓臨床治療的重要環(huán)節(jié)，一旦確診，應(yīng)在生活方式干預(yù)的同時，立即采用藥物治療。高血壓患者在接受同一種藥物治療時，其治療效果、產(chǎn)生的毒副作用及其對藥物的耐受性等存在明顯差異。遺傳多態(tài)性是造成不同個體之間藥物反應(yīng)差異的根本原因[4]。細胞色素P450同工酶2D6（cytochrome P450 2D6，CYP2D6）、細胞色素P450同工酶2C9（cytochrome P450 2C9，CYP2C9）、β1腎上腺素受體（betal-adrenergic receptor-1，ADRB1）、血管緊張素Ⅱ受體1（angiotensin Ⅱ receptor 1，AGTR1）以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）是與降壓藥物相關(guān)的基因[5]。本研究擬采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合熔解曲線（簡稱PCR熔解曲線法）檢測CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、ACE rs1799752位點的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），并與DNA測序法比較，初步評估PCR熔解曲線法的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年10—12月中日友好醫(yī)院就診的原發(fā)性高血壓患者100例，其中男61例、女39例，年齡28～75歲。納入標準：依據(jù)《中國高血壓防治指南（2010年修訂版）》[6]中原發(fā)性高血壓的診斷標準，在未使用降壓藥物的情況下，非同日3次測量血壓，收縮壓≥18.62 kPa（140 mmHg）和/或舒張壓≥11.97 kPa（90 mmHg）。排除標準：嚴重肝、腎功能損傷者（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶>參考區(qū)間上限3倍，血肌酐>178 μmol/L、血尿素氮>9 mmol/L），繼發(fā)性高血壓患者，對β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑這五大類藥物有禁忌癥者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有患者靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4 ℃保存，24 h內(nèi)提取基因組DNA。

1.2.2 試劑與儀器 CYP2D6*10（c.100C>T）、CYP2C9*3（c.1075A>C）、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）檢測試劑盒購自無錫銳奇生物科技有限公司。血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。干擾物血紅蛋白（hemoglobin，Hb）購自生工生物工程（上海）有限公司，膽紅素（bilirubin，Bil）及三酰甘油（triglyceride，TG）購自北京索萊寶科技有限公司。Gentier 96E熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司）。2×Premix Taq測序試劑盒（RR901A）購自寶生物工程（大連）有限公司。ABI 3730自動測序儀（美國ABI公司），nanodrop one紫外分光光度計（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2.3 核酸提取 提取人類基因組DNA，采用nanodrop one紫外分光光度計測定所提取的DNA濃度和純度，要求A260nm/A280nm比值為1.8～2.0，濃度為10～100 ng/μL。

1.2.4 PCR熔解曲線法 嚴格按試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，5個檢測位點分3個反應(yīng)孔進行，反應(yīng)體系混勻后分裝至PCR管中，每管18 μL（反應(yīng)液Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc各8 μL，反應(yīng)液Ⅱ 5 μL，反應(yīng)液A 5 μL），然后加入2 μL樣本DNA。按試劑盒說明書提供的反應(yīng)程序進行擴增及熔解曲線分析，5個位點反應(yīng)條件一致。

1.2.5 測序 采用Primer 5軟件設(shè)計覆蓋CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、ACE rs1799752共5個SNP位點序列的10條引物。根據(jù)2×Premix Taq測序試劑盒要求建立PCR反應(yīng)體系（20 pmol引物、2×Premix Taq 25 μL、模板DNA 200 ng，滅菌水補齊到50 μL）。測序引物序列：AGTR1正向引物5'-TGCACCATGTTTTGAGGTTG-3'，反向引物5'-TTGTTCTTCGAGCAGCCGTCAT-3'；CYP2C9正向引物5'-ACAGGAGCCACATGCCCTAC-3'，反向引物5'-GGGACTTCGAAAACATGGAGTT-3'；ACE正向引物5'-AAGCCACTGCTGGAGAGCCACTCCCAT-3'，反向引物5'-TTCCGGGACGTGGCCATCACATTC-3'；CYP2D6正向引物5'-TGCTCCTGGTGGACCTGATG-3'，反向引物5'-CTGGTCGAAGCAGTATGGTG-3'；ADRB1正向引物5'-GCCCTCGCGCCTCGTG-3'，反向引物5'-GCGGCACGGCTCGTCCA-3'。

1.2.6 結(jié)果判讀 PCR熔解曲線法結(jié)果判讀標準：以AGTR1（1166A>C）為例，以對照品反應(yīng)管為參照，同時出現(xiàn)與對照品相同的2個峰（Tm值偏差<1.5 ℃）的樣本為AC雜合子，只出現(xiàn)1個低Tm值熔解峰的樣本為AA純合子，只出現(xiàn)1個高Tm值熔解峰的樣本為CC純合子。所有檢測均重復(fù)3次。

1.2.7 符合率 以測序法檢測結(jié)果作為標準，計算PCR熔解曲線法的符合率。

1.2.8 重復(fù)性 隨機選取5例樣本，平行檢測3次。將2個等位基因熔解峰的Tm值分別記為Tm1及Tm2，計算5個基因位點Tm值的極值（R）。

1.2.9 抗干擾能力 Hb、Bil、TG為生物組織樣本中最常見的生物源性PCR干擾物質(zhì)，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A文件中的推薦濃度，將Hb、Bil、TG的粉末狀干擾物分別配制成初始濃度為2 g/L、342 μmol/L、37 mmol/L的原液。對干擾物原液分別進行10倍、100倍、1 000倍稀釋。在同一全血樣本中分別加入干擾物原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液及1 000倍稀釋液。采用PCR熔解曲線法檢測CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、ACE rs1799752，重復(fù)檢測3次。以未加干擾物的樣本作為對照，觀察加入不同濃度干擾物后基因型檢測結(jié)果的一致性，計算熔解曲線Tm值的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SSPS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，重復(fù)性比較采用Kappa檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR熔解曲線法與測序法檢測結(jié)果的符合率

PCR熔解曲線法與測序法對100例高血壓患者的檢測結(jié)果均一致，符合率為100%。5個基因的測序結(jié)果及熔解曲線見圖1。

圖1 PCR熔解曲線法與測序法結(jié)果的比對

2.2 重復(fù)性

5個基因位點Tm值的極值（R）均<0.5 ℃。見表1。

表1 5個基因位點Tm值的重復(fù)性 ℃

2.3 抗干擾能力

Hb≤2 g/L、Bil≤342 μmol/L、TG≤37 mmol/L對PCR熔解曲線法無影響（Tm值的CV均≤5%）。見表2。

表2 PCR熔解曲線法檢測5個基因位點的抗干擾能力

2.4 5個基因的基因頻率

Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），具有群體代表性。

100例高血壓患者的5個基因中，AGTR1（c.1166A>C）及CYP2C9*3（c.1075A>C）純合突變型各1例，ACE（I/D）、CYP2D6*10（c.100C>T）及ADRB1（c.1165G>C）的突變型等位基因頻率均較高，分別為35.0%、39.5%及62.0%。各位點的基因型頻率與等位基因頻率見表3。

表3 5個基因位點的基因型頻率及等位基因頻率分布 %

3 討論

本研究主要評估了高血壓患者對臨床常用降壓藥物的機體代謝情況及藥物敏感性，可用于指導(dǎo)臨床選擇合適的降壓藥物，優(yōu)化藥物治療方案，提升降壓效果，盡可能避免不良反應(yīng)，實現(xiàn)臨床高血壓治療的個性化用藥。本研究結(jié)果顯示，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物相關(guān)基因ACE缺失型D等位基因頻率占35% ，這與李露等[7]統(tǒng)計的亞洲人群ACE基因D等位基因頻率（39.0%）類似。ACE基因DD純合型個體使用貝那普利和福辛普利鈉片的療效顯著，II純合型個體使用依那普利和咪達普利的療效顯著，ID雜合型個體使用ACEI類藥物治療均有效[4]。AGTR1 A116C多態(tài)性及CYP2C9*3多態(tài)性會影響血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）類藥物的藥效，產(chǎn)生不良反應(yīng)，CYP2C9*3突變會導(dǎo)致酶活性降低，攜帶者服用洛沙坦后，活性代謝物會減少，藥物敏感性降低[8-9]，AGTR1（c.1166A>C）CC基因型會使患者對ARB類藥物的敏感性更高[10]。本研究結(jié)果顯示，AGTR1（c.1166A>C）的C等位基因頻率為5.0%，CYP2C9*3（c.1075A>C）的C等位基因頻率為5.0%，由此推斷，大多數(shù)高血壓患者對ARB類藥物的敏感性及代謝均處于正常水平。與β受體阻滯劑相關(guān)的基因位點CYP2D6*10（c.100C>T）是亞洲人群常見的突變之一，發(fā)生率約為50%[11]。本研究結(jié)果顯示，CYP2D6*10（c.100C>T）突變發(fā)生率為39.5%，低于文獻報道[11]的結(jié)果，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。CYP2D6*10（c.100C>T）突變會導(dǎo)致CYP2D6代謝β受體阻滯劑的代謝能力顯著下降，血藥濃度升高，不良反應(yīng)風(fēng)險增加[9]。另1個與β受體阻滯劑相關(guān)的基因位點為ADRB1，其編碼的蛋白是β受體阻滯劑類藥物降壓作用的靶點，ADRB1（c.1165G>C）純合突變型對β受體阻滯劑的敏感性更強[12]。

現(xiàn)有的基因突變檢測技術(shù)在基因篩查中各有局限性，如以PCR為基礎(chǔ)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析易受雜交條件及洗脫條件的影響，因此不適用于臨床常規(guī)檢測；PCR結(jié)合反向點雜交技術(shù)檢測突變位點時依靠等位基因特異性探針與目的DNA的雜交，結(jié)果需要人工判定，因其檢測過程中需要開蓋轉(zhuǎn)移擴增產(chǎn)物，因此環(huán)境極易受到污染，這也限制了其在大規(guī)模篩查中的使用；高分辨熔解曲線每次只能檢測1個位點，無法進行大規(guī)模檢測；作為檢測突變“金標準”的DNA測序成本較高，且檢測時間長，不適用于基因突變的常規(guī)檢測。本研究使用的PCR熔解曲線法的檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果的一致性為100%，準確性、重復(fù)性及抗干擾性較強，方法簡便、靈活，對設(shè)備硬件要求較低，適用于普通PCR實驗室，因此可作為高血壓藥物相關(guān)基因SNP位點的常規(guī)檢測方法。

綜上所述，PCR熔解曲線法操作簡便、對設(shè)備要求低，可作為檢測高血壓藥物相關(guān)基因突變的常規(guī)方法，有助于臨床制定最佳的治療方案，并進行用藥指導(dǎo)。