UroQuick尿液快速培養技術在兒童尿路感染診斷中的應用

潘 芬， 潘雨萱， 石迎迎， 于方圓， 張 泓

（上海市兒童醫院 上海交通大學醫學院附屬兒童醫院檢驗科，上海 200062）

尿路感染（urinary tract infection，UTI）是兒童常見的感染之一[1-2]。清潔中段尿細菌定量培養是診斷UTI的金標準。然而，傳統尿液培養一般需要3～4 d才能到細菌鑒定及藥物敏感性結果，且存在70%～80%的假陰性率，嚴重影響了臨床的及時治療[3-4]。有研究發現，UroQuick快速培養法可在較短時間內報告病原及其定量結果，有助于臨床早期診斷[5-6]。本研究擬通過比較UroQuick快速培養法和尿液定量培養法檢測結果，探討UroQuick快速培養用于快速診斷、鑒別及排除兒童UTI的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2019年12月—2020年1月上海市兒童醫院門診及住院的235例疑似UTI的0～14歲患兒清潔中段尿樣本（剔除尿液污染或留取不規范的樣本），患兒男性132例、女性103例。

1.2 儀器與試劑

UroQuick尿液快速培養儀及配套試劑（意大利ALIFAX公司），MALDI-TOF質譜儀（德國Bruker公司），哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱平板（上海伊華生物有限公司）。

1.3 尿液定量培養及細菌鑒定

嚴格按照第4版《全國臨床檢驗操作規程》[7]要求進行清潔中段尿樣本細菌培養。用10 μL定量接種環獲取尿液，分別接種于血瓊脂平板和麥康凱平板，置于37 ℃、5%CO2環境下孵育18～20 h。當平板菌落數≥10個時，挑取平板上單個菌落進行分離純化，并采用MALDITOF質譜儀鑒定到種。

1.4 UroQuick尿液快速培養

嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作，采用無菌操作取500 μL的中段尿液，加入2 mL液體培養基中，混勻后放入UroQuick尿液快速培養儀中孵育培養，通過激光散射技術實時監測生長動力學曲線，當培養瓶內有細菌生長（閾值為500 CFU/mL）時，儀器會給出樣本的濁度值，并根據生長曲線采用非線性最小二乘擬合的算法計算出原始樣本中的菌量濃度。

培養報陽后，采用一次性針頭抽取1 mL液體培養基于1.5 mL Eppendorf管中，1 3 8 0 0×g離心5 m i n，棄上清，再加入300 μL 0.9%氯化鈉溶液，混勻后繼續離心5 min，去除多余的蛋白質，再13 800×g離心5 min，棄上清，取適量沉淀物涂抹于MALDITOF靶板上，采用甲酸提取法[8]和MALDI-TOF質譜儀快速鑒定細菌到種。同時，將離心沉淀物進行革蘭染色涂片，分別接種于血瓊脂平板和麥康凱平板，第2天觀察菌落形態，并進一步鑒定以明確快速質譜鑒定結果是否準確；若3 h內呈陰性，則轉種于血瓊脂平板，于37 ℃5%CO2環境下孵育18～20 h，第2天觀察細菌生長情況，以明確是否為陰性結果。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。非正態分布計量資料采用中位數（M）[四分位數（P2.5～P97.5）]表示。以尿液定量培養為金標準，分別按照濁度值和菌量濃度計算原則，采用McNemar χ2檢驗和Kappa檢驗分析UroQuick快速尿液培養法的差異性和一致性。采用MedCalc軟件計算UroQuick快速培養診斷UTI的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中段尿定量培養結果

235例清潔中段尿樣本中，有58例培養出病原菌，陽性率為24.7%，其中43例培養出細菌，4例培養出真菌，11例2種病原均檢出。43株細菌中，革蘭陰性桿菌27株（62.8%），以大腸埃希菌多見；革蘭陽性球菌16株（37.2%），以屎腸球菌多見。見表1。

2.2 UroQuick尿液快速檢測結果

235例清潔中段尿樣本中，按照濁度值計算，UroQuick檢測法為陽性的有69例，陽性率為29.4%，其中55例培養出細菌、3例培養出真菌，11例2種病原均檢出。55株細菌中，革蘭陰性桿菌35株（63.6%），以大腸埃希菌多見；革蘭陽性球菌有20株（36.4%），以屎腸球菌多見；見表1。UroQuick檢測法陽性檢出率高于中段尿定量培養法，部分結果不一致的樣本進一步結合尿常規檢測綜合分析，仍判斷為感染菌。

2.3 2種方法檢測結果比較

以常規中段尿定量培養作為金標準，將235例樣本分為陰性組（177例）和陽性組（58例），分析UroQuick尿液快速培養法的濁度值和菌量濃度（圖1），結果顯示，陰性組濁度值中位數為0，陽性組濁度值中位數為1.39，2個組之間差異有統計學意義（P<0.001）；陰性組的菌量濃度為0 CFU/mL，陽性組菌量濃度為50萬 CFU/mL，2個組之間差異有統計學意義（P<0.001）。進一步分析2種方法細菌檢出結果的一致性，結果顯示，2種方法一致率為86.8%（204/235），其中陰性一致率為91.0%（161/177），陽性一致率為74.1%（43/58）。將2種方法分別與MALDI-TOF質譜鑒定結果結合，用于細菌鑒定，發現除2種或2種以上病原鑒定率較低外，UroQuick檢測法4～5 h即可得到病原鑒定結果，而尿液定量培養則需要18～24 h才能獲得結果。

圖1 UroQuick快速培養法在尿液定量培養陰性組和陽性組中的濁度、菌量濃度分布

2.4 UroQuick尿液快速檢測方法診斷UTI的效能

以常規中段尿液定量培養為金標準，以UroQuick檢測的濁度值作為計算原則，UroQuick快速培養法診斷UTI的敏感性為84.48%，特異性為88.70%，陽性預測值為71.01%，陰性預測值為94.58%；以UroQuick檢測的菌量濃度作為計算原則，UroQuick快速培養法診斷UTI的敏感性為82.76%，特異性為92.66%，陽性預測值為78.69%，陰性預測值為94.25%。見表2。

表2 UroQuick快速培養法診斷UTI的效能

UroQuick尿液快速培養法濁度與菌量濃度的相關性分析結果顯示，有8例樣本僅有濁度值，而菌量濃度為0 CFU/mL；進一步將上述樣本接種于相應平板，培養結果均為陽性?？紤]其可能是中段尿樣本菌量較少，未達到檢測閾值或其他樣本內在因素導致的。見表3。

表3 UroQuick快速培養法濁度與菌量濃度不符合樣本

3 討論

UTI是兒童常見的感染性疾病之一，由于兒童年齡較小、清潔中段尿樣本取樣較為困難等因素，使得兒童UTI的病原菌檢出陽性率較低。目前針對兒童細菌UTI的診斷閾值存在年齡差異[9-10]，準確判斷清潔中段尿液樣本中病原的菌量對診斷兒童UTI具有較為重要的意義。然而，傳統細菌培養操作步驟較為繁瑣、檢測周期較長，亟需一種快速培養技術用于UTI的快速診斷。

UroQuick尿液快速培養技術基于液體培養實時監測細菌生長，能在3 h內快速檢出清潔中段尿樣本中是否存在細菌，并明確相應的濃度[11]。UroQuick檢測一般根據細菌生長動力學曲線給出濁度值和菌量濃度，本研究以常規中段尿定量培養法為金標準，發現尿液培養陰性組與陽性組濁度和菌量濃度差異均有統計學意義（P<0.05），且2種方法結果一致性較好，這與UroQucik僅檢測活菌生長，紅細胞、白細胞、上皮細胞等其他干擾因素由最初的空白值讀數消除有關，也說明無論按照濁度值還是按照菌量濃度計算，均能有效區分該樣本中是否存在活菌。進一步評估UroQuick快速培養法診斷UTI的效能，發現無論按照濁度還是按照菌量濃度計算，該方法的敏感性均>80%，且對高濃度菌量的樣本敏感性高于低濃度樣本，但略低于國外的研究報道[11-12]。本研究發現，UroQuick快速培養法按菌量濃度計算診斷UTI的特異性高于按濁度值計算（92.66%和88.70%），但陰性預測值均>90%，提示UroQuick快速培養法快速篩查UTI具有較大的價值，尤其對菌量濃度為0的樣本，建議用濁度值作為樣本是否存在病原的判斷標準。本研究將UroQuick快速培養法與MALDI-TOF技術相結合用于細菌鑒定，發現UroQuick快速培養法檢測單一病原菌生長的報陽尿液樣本，可在3 h內得到陽性結果，離心取沉淀進行MALDI-TOF質譜鑒定，可在1 h內直接鑒定病原到種，2種方法聯合用于單一生長的病原檢測共耗時4～5 h，明顯縮短了尿液培養的時間，當天即可給予臨床醫生病原檢測報告，有助于臨床醫生及時根據病原種類調整用藥，控制病情發展[13]。但該方法不適用于多種細菌生長的樣本。

此外，本研究尿液定量培養檢出的58例陽性結果中，有43例檢出細菌、4例檢出真菌、11例2種病原均檢出；而UroQuick快速培養法檢出的69例陽性結果中，有55例檢出細菌、3例檢出真菌，1例2種病原均檢出；2種方法一致率為86.8%，且對大多數常見細菌（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌）檢出情況較為一致。但仍有31例樣本檢測結果不一致，主要有2種情況：（1）針對部分菌量較低的尿液樣本，由于UroQucik快速培養法檢測閾值為500 CFU/mL，因此部分濃度較低且常規定量接種法為陰性的樣本易被檢出；（2）針對部分多種病原生長的樣本，常規定量接種法采用10 μL的接種量，會導致菌量較少的病原被菌量較多的病原掩蓋，常規方法無法區分，而UroQuick快速培養法加入500 μL進行孵育，使得部分多種病原生長的樣本更容易被檢出。建議采用UroQuick快速培養法檢測細菌濃度較低的中段尿樣本時結合尿常規或患者臨床癥狀來確定其是否為感染病原菌。本研究中，UroQuick快速培養法未檢出尿液樣本中含有的銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、皮氏不動桿菌，3例樣本分別培養為陰性、奇異變形桿菌和2種細菌生長，綜合3例患兒的尿常規情況，考慮可能是在菌量濃度較低或操作過程中有污染。由于UroQuick快速培養法的原理是基于激光散射技術，根據細菌生長特性，分別從30°和90° 2個方向采集細菌顆粒的散射光，并采用非線性最小二乘擬合的算法計算出原樣本中的細菌濃度，所以存在以下問題：（1）該方法尚無法區別感染菌與污染菌，對多種病原生長的尿液樣本的診斷意義仍有待進一步探討[13]；（2）UroOucik快速培養法僅給出尿液樣本中細菌的濁度值和濃度值，無法檢測尿液中的白細胞，建議在使用該方法時結合尿常規結果綜合判斷；（3）本研究設定的UroQuick快速培養法的最低檢測限為500 CFU/mL，當尿液樣本較渾濁，且菌量較少時，可能會影響病原的檢出，建議對此類樣本進行適當稀釋，以減少蛋白或白細胞等因素的影響。

綜上所述，UroQuick快速培養法可作為一種新的尿液快速培養技術，無論按照濁度結果還是菌量濃度結果計算均具有較好的特異性和陰性預測值，可用于兒童UTI的早期篩查。此外，UroQuick檢測法3 h即可得到細菌濃度的檢測結果，結合MALDI-TOF質譜鑒定技術可直接對報陽后的樣本（單一細菌生長）進行細菌鑒定（種），縮短了清潔中段尿液樣本的培養時間，為兒童UTI提供快速的病原學診斷依據，未來若能將快速培養技術與藥物敏感性試驗相結合，也能在一定程度上縮短藥物敏感性試驗報告時間，有助于兒童UTI的早期診療。