干擾ENST00000415026負調(diào)控miR-653增強小細胞肺癌對阿帕替尼的敏感性

李哲 柳志寶 孫震 李華蕊

(滄州市中心醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)一科，河北 滄州 061000；2胸外科；3營養(yǎng)科)

肺癌是目前臨床上最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率較高，小細胞肺癌是肺癌的一種，雖僅占肺癌的20%左右，但其惡性程度高，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移〔1〕。雖然，小細胞肺癌患者對化療和放療有良好初始反應(yīng)性，然而很多患者化療后很快復(fù)發(fā)，耐藥性是造成化療失敗的主要原因〔2〕。因此，克服小細胞肺癌的化療耐藥對臨床治療小細胞肺癌有重要意義。阿帕替尼是一種口服小分子抗血管生成劑，可抑制腫瘤血管生長；研究報道阿帕替尼對晚期一線或一線以上治療失敗的小細胞肺癌患者有一定的臨床獲益，安全性可控〔3，4〕，表明阿帕替尼治療小細胞肺癌有良好效果，提高小細胞肺癌對阿帕替尼的敏感性能進一步提高其療效。研究表明lncRNA可在轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)控相關(guān)基因水平的表達，從而影響小細胞肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥〔5〕。王亞芳等〔6〕利用高通量lncRNA芯片技術(shù)分別檢測發(fā)生轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的小細胞肺癌組織中差異表達的lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENST00000415026在發(fā)生轉(zhuǎn)移的小細胞肺癌組織中高表達；提示ENST00000415026可能參與了小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的惡性表型；但其對小細胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響及機制還尚不清楚。研究報道m(xù)iR-653高表達可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡〔7〕。上調(diào)miR-653可抑制膀胱癌的生長〔8〕，表明上調(diào)miR-653可抑制肺癌及膀胱癌細胞的生長。但miR-653對小細胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響尚不清楚。本研究旨在探討ENST00000415026對小細胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1一般臨床資料 收集2018年1月至2020年1月河北省滄州市中心醫(yī)院具有完整資料的26例小細胞肺癌和癌旁組織標(biāo)本。其經(jīng)病理檢測為小細胞肺癌，患者手術(shù)前未進行手術(shù)及放化療，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的組織作為癌旁組織，所有患者同意且簽署知情書。

1.2細胞與主要試劑 A549細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；阿帕替尼購自美國Selleck公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3阿帕替尼耐藥細胞的培養(yǎng) A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)基中加入阿帕替尼培養(yǎng)，阿帕替尼起始濃度為0.001 μg/ml，刺激48 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，選擇存活細胞繼續(xù)逐漸增加阿帕替尼濃度(0.010 μg/ml、0.100 μg/ml)進行培養(yǎng)，直到最后在1.00 μg/ml阿帕替尼濃度下能穩(wěn)定存活，命名為A549/APA細胞。分別用0.001 μg/ml、0.010 μg/ml、0.100 μg/ml、1.000 μg/ml阿帕替尼刺激A549和A549/APA細胞，用CCK-8檢測細胞存活率，進一步確定A549/APA細胞耐藥，以正常培養(yǎng)的A549細胞作為對照組。

1.4細胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期細胞A549/APA，將ENST00000415026干擾表達載體(si-ENST00000415026)及陰性對照(si-NC)轉(zhuǎn)染至A549/APA細胞中，記為si-ENST00000415026組、si-NC組；將si-ENST00000415026分別與miR-653抑制劑(anti-miR-653)及陰性對照(anti-miR-NC)共轉(zhuǎn)染至A549/APA細胞中，記為si-ENST00000415026+anti-miR-653組、si-ENST00000415026+anti-miR-NC組。

1.5CCK-8檢測細胞存活率 選擇不同濃度阿帕替尼刺激的A549和A549/APA細胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測細胞490 nm波長處的吸光度值(A)。細胞存活率(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測ENST00000415026和miR-653的表達水平 提取肺癌組織、癌旁組織及A549、A549/APA和各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后按照熒光定量試劑盒說明建立終體積為20 μl PCR體系(2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無菌水)；PCR條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；相對表達量用2-△△Ct計算。ENST00000415026和miR-653分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參，ENST00000415026上游引物序列：5′-GACAGACCTCCAGCTTCCAG-3′，下游引物序列：5′-TTCAGAAGGACAGCCGAAGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-653上游引物序列：5′-TTCACTGGAGTTTGTTTCAAT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7流式細胞儀檢測細胞周期 收集細胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，離心棄上清；然后重懸細胞，加入預(yù)冷的80%乙醇，4℃固定過夜；用PBS洗滌細胞3次，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃孵育30 min，加入PI染色液4℃染色15 min，上機檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行分析。

1.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸后分別加入10 μl的Annexin V-FITC和加入5 μl PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9熒光素酶報告實驗檢測ENST00000415026和miR-653的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測顯示ENST000 00415026與miR-653存在結(jié)合位點。構(gòu)建ENST0 0000415026的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-ENST00000415026和MUT-ENST00000415026，用LipofectamineTM 2000將其分別與miR-NC和miR-653共轉(zhuǎn)染至細胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.10Western印跡檢測Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行定量。取50 μl蛋白樣品于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h；加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達水平=目的條帶和GAPDH條帶的比值。

1.11統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1APA對A549和A549/APA細胞活性的影響 與對照組相比，當(dāng)阿帕替尼濃度≥0.100 μg/ml時A549細胞存活率顯著降低(P<0.05)，而阿帕替尼濃度為1.000 μg/ml時A549/APA細胞存活率無顯著變化(P>0.05,表1)；表明A549/APA細胞對阿帕替尼耐藥，將其作為肺癌耐阿帕替尼細胞。

2.2ENST00000415026在肺癌中的表達 與癌旁組織(0.96±0.11)相比，肺癌組織中ENST0000 0415026表達水平(3.28±0.24)顯著升高(P<0.05)；與A549細胞(3.39±0.11)相比，A549/APA細胞中ENST00000415026表達水平(4.54±0.14)也顯著升高(P<0.05)。

2.3干擾ENST00000415026對A549/APA增殖凋亡的影響 與si-NC組相比，si-ENST00000415026組ENST00000415026表達水平顯著降低，miR-653表達水平顯著升高，G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細胞所占比例無顯著變化(P>0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 APA對A549和A549/APA細胞 存活率的影響

圖1 干擾ENST00000415026對A549/APA 凋亡率的影響

表2 干擾ENST00000415026對A549/APA增殖凋亡的影響

2.4ENST00000415026靶向miR-653 StarBase在線軟件預(yù)測顯示ENST00000415026與miR-653存在結(jié)合位點(圖2)。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-653組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ENST00000415026的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染MUT-ENST00000415026的細胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05),表3。

2.5抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理A549/APA增殖凋亡的影響 與si-ENST0000 0415026+anti-miR-NC組相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653組miR-653、G0-G1期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2-M期細胞所占比例無顯著變化(P>0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，圖3，表4。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖3 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理 A549/APA凋亡的影響

表4 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理A549/APA增殖凋亡的影響

2.6Western印跡檢測細胞中Ki67、Caspase-3蛋白表達 與si-NC組相比，si-ENST00000415026組Ki67表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)；與si-ENST00000415026+anti-miR-NC組相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653組Ki67表達水平顯著升高，Caspase-3表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖4，表7。

1～4：Si-NC組、si-ENST00000415026組、si-ENST00000415026+anti-miR-NC組、si-ENST00000415026+anti-miR-653組圖4 Ki67、Caspase-3蛋白表達

表7 各組細胞中Ki67、Caspase-3蛋白表達

3 討 論

小細胞肺癌惡性程度高，侵襲性強，進展迅速，臨床以化療和放療為主要治療手段，在放化療失敗后缺乏有效治療手段，抗血管生成治療在晚期小細胞肺癌中表現(xiàn)出一定療效〔9〕；研究表明新型的抗血管生成劑阿帕替尼對標(biāo)準治療失敗的晚期肺癌有明顯療效，且不良反應(yīng)可控〔10〕。研究表明lncRNA參與調(diào)控腫瘤細胞化療藥物的耐藥性與敏感性，研究其在腫瘤中的作用機制，可為提高化療藥物敏感性提供參考依據(jù)〔11〕。研究表明ENST00000415026在小細胞肺癌中高表達〔6〕；本研究結(jié)果表明ENST00000415026可能與A549細胞的阿帕替尼耐藥性相關(guān)。Ki67是細胞核增殖抗原，抑制Ki67可抑制細胞增殖〔12〕；Caspase-3是細胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子，Caspase-3高表達可誘導(dǎo)細胞凋亡〔13〕。表明干擾ENST00000415026可抑制A549/APA細胞增殖，促進細胞凋亡；干擾ENST00000415026可增強A549細胞對阿帕替尼的敏感性。

研究表明lncRNA可與miRNA相互作用參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔14〕。研究報道circ-RAD23B可通過miR-653-5p促進非小細胞肺癌細胞生長和侵襲〔15〕。沉默circ_0004771通過激活miR-653抑制乳腺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡〔16〕。表明miR-653高表達可抑制癌細胞生長，促進細胞凋亡。

綜上，干擾ENST00000415026可能通過上調(diào)miR-653增強小細胞肺癌對阿帕替尼的敏感性。