青藤堿通過阻止NF-κB通路激活抑制IL-1β誘導的椎間盤終板軟骨細胞炎癥及退變

付美艷 楊鏡以 溫欣 田薇

(1烏魯木齊市友誼醫院中醫科，新疆 烏魯木齊 830049；2杭州海亮馨蕙馨醫院中醫科；3新疆醫科大學公共衛生學院)

椎間盤退變是導致椎間盤退行性病變(IVDD)的病理基礎改變，是導致頸部、下腰部疼痛及功能障礙的主要病因〔1〕。流行病學顯示下腰部疼痛已成為全球致殘的主要病因〔2〕。終板軟骨作為椎間盤組織的重要組成部分，其可維持椎間盤形態，供應椎間盤營養，吸收和分離脊柱機械負荷的重要壓力，防止髓核向鄰近椎體突出〔2，3〕。終板軟骨細胞的炎癥及退變與IVDD呈顯著相關性〔4〕。青藤堿是一種從藥用植物青藤中提取出來的單體，既往研究顯示青藤堿具有顯著免疫調節、抗感染、抗腫瘤等作用〔5〕。鄭潔等〔6〕指出青藤堿可以顯著抑制家兔膝關節骨性關節炎模型中的滑膜炎癥并延緩軟骨退變。青藤堿對于椎間盤軟骨細胞炎癥及退變作用的相關研究較少，本研究旨在探討青藤堿對于椎間盤軟骨細胞炎癥及退變的療效并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 采取7周齡雄性SD大鼠8只，體重(150±24)g。水合氯醛、青藤堿(純度≥95%)、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清均自北京索萊寶生物有限公司；DMEM-F12培養基、雙抗(青鏈霉素)、白細胞介素(IL)-1β購自美國Invitrogen公司；聚合酶鏈反應(PCR)逆轉錄及mix試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質金屬蛋白酶(MMP)-13、聚蛋白多糖酶(ADAMTS)5的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及核轉錄因子(NF)-κB、IκB、IκK二抗購自美國Proteintech公司；NF-κB、IκB、IκK一抗購自美國CST生物公司；CCK-8檢測試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2大鼠椎間盤終板軟骨細胞提取與培養 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后逐層切開大鼠背部，顯露椎間盤，取出并放入含有1%雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)冰盒中，并迅速轉移至超凈臺內。PBS清洗椎間盤表面，去除肌肉、滑膜等軟組織，取出軟骨組織轉移至另一培養皿中，再次加入含1%雙抗的PBS，清洗3次后使用眼科剪將軟骨組織剪成1×1×1 mm3大小的碎塊，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶消化6 h后將懸液倒入120目不銹鋼濾網過濾。將濾過的懸液使用離心機100 r/min離心5 min，吸棄上清后加入PBS清洗，再次予以離心5 min后加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM-F12培養基重懸。吹打混勻后接種于培養皿中，放入恒溫培養箱中孵育。每2～3 d換液1次，細胞鋪滿培養皿的80%～90%時用胰酶消化傳代并記為第1代，取第3～5代細胞用于實驗。

1.3CCK-8法檢測不同濃度青藤堿對軟骨細胞活力的影響 取培養后第3～5代軟骨細胞并接種于96孔板中，孵育24 h后分別加入不同濃度的青藤堿(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)，再次孵育24 h后向每孔加入10 μl CCK-8。放入培養箱中再次孵育3 h后放于酶標儀中檢測各孔在450 nm的吸光度，計算各濃度青藤堿對軟骨細胞活力的影響。

1.4細胞分組與干預 將軟骨細胞分為5組，即對照組、IL-1β組、0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤堿組。除對照組外，其余4組均予以IL-1β(1 μg/ml)干預模仿終板軟骨退變環境。

1.5ELISA檢測不同濃度青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5的影響 收集各組干預后細胞上清，使用ELISA檢測各組IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5含量，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量后操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒中操作說明書執行。

1.6qPCR檢測不同濃度青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5的影響 干預24 h后加入PBS洗滌，棄PBS后加入1 ml Trizol，將細胞吹打懸浮并移入1.5 ml離心管中，靜置20 min后加入0.2 ml氯仿，混勻后靜置5 min，隨后于12 000 r/min離心15 min。取上層水相并加入同體積異丙醇，再次混勻靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。棄上清后加入70%無水乙醇1 ml，混勻后7 500 r/min離心5 min，再次加入無水乙醇，離心后棄上清，所得沉淀即為mRNA，晾干加入20 μl DEPC水混勻，60℃金屬浴10 min。使用分光光度儀檢測mRNA濃度，按照逆轉錄試劑盒操作將其反轉錄為cDNA，隨后按照說明書上機檢測。引物序列：IL-6：上游5′-CTGCGCAGAATGAGATGA-3′，下游5′-CCAGAGCTGTGCAGATGA-3′；TNF-α上游5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′，下游5′-GGATGAACACGCCAGTCGCC-3′；MMP-13上游5′-CCAGAACTTCCCAACCAT-3′，下游5′-ACCCTCCATAATGTCATAC-3′；ADAMTS5上游5′-TATGTTCTCCA-GAGCGCAGC-3′，下游5′-GGAATCGTCATGGGAG-AGGC-3′；GAPDH上游5′-TCTCCTCTGACTTCAACAGCGAC-3′，下游5′-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。

1.7Western印跡檢測不同濃度青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞中NF-κB、IκB及IκK的影響 各組細胞干預24 h后棄上清，PBS洗滌后加入細胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰上裂解30 min后12 000 r/min離心15 min，吸取上清并加入1/4上清體積上樣緩沖液，100℃金屬浴5 min后放入-80℃凍存。根據所測分子量大小選用8%～12%的分離膠進行電泳，隨后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗放入4℃過夜，TBST清洗4次，5 min后二抗孵育1 h，再次使用TBST洗膜后加入電化學發光(ECL)上機顯影。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1CCK-8法檢測不同濃度青藤堿對終板軟骨細胞活力的影響 0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤堿組大鼠椎間盤終板軟骨細胞增殖活力〔(1.19±0.02)%、(1.21±0.02)%、(1.32±0.03)%〕顯著高于對照組或0 mmol/ml青藤堿組〔(1.00±0.00)%、(1.01±0.01)%〕，且呈濃度依賴性(均P<0.05)；5.0、10.0 mmol/ml青藤堿組大鼠椎間盤終板軟骨細胞增殖活力〔(0.80±0.03)%、(0.68±0.04)%〕顯著低于對照組或0.0 mmol/ml青藤堿組(P<0.05)。因此，選用0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤堿用于后續研究。

2.2ELISA檢測青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞炎性因子及軟骨退變的影響 IL-1β組細胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，0.1、0.5、1.0 mmol/ml青藤堿組細胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白表達顯著低于IL-1β組，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3qPCR檢測青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞炎性因子及軟骨退變的影響 IL-1β組細胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)，0.5、1.0 mmol/ml青藤堿組細胞上清中IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5 mRNA表達均顯著低于IL-1β組(P<0.05)。見表2。故選用0.5、1.0 mmol/ml青藤堿用于后續研究。

2.4Western印跡檢測青藤堿對IL-1β誘導后軟骨細胞NF-κB通路的影響 IL-1β組終板軟骨細胞NF-κB、IκK表達顯著高于對照組，IκB表達顯著低于對照組(P<0.05)；0.5、1.0 mmol/ml青藤堿組終板軟骨細胞NF-κB、IκK顯著低于IL-1β組，IκB表達顯著高于對照組(P<0.05)。表明0.5、1.0 mmol/ml青藤堿可以明顯逆轉IL-1β誘導NF-κB信號通路激活。見表2，圖1。

表1 ELISA檢測各組IL-6、TNF-α、MMP-13及ADAMTS5蛋白

表2 qPCR檢測各組IL-6、TNF-α、MMP-13、ADAMTS5的mRNA水平及軟骨細胞中NF-κB通路指標比較

3 討 論

IVDD是引起下腰痛的主要疾病之一，有高達80%的成年人受到IVD的影響〔7〕。目前治療IVDD的主要方法多為物理鍛煉、抗炎止痛及手術〔8〕。然而手術作為治療IVDD的終極方法，其仍然存在明顯的并發癥，如復發、療效不滿意、生物力學特性改變及加速周圍結構的退變等〔9〕。終板軟骨作為提供椎間盤營養的主要途徑，其退變可顯著降低營養物質的運輸，最終導致IVDD〔2，3，10〕。而終板軟骨細胞是終板軟骨中唯一的細胞類型，具有分泌細胞外基質(ECM)及維持細胞穩態的重要作用，其炎癥及退變與IVDD呈顯著相關性〔11〕。此外，由于椎體終板軟骨具有十分精細的血管供應至椎間盤，其可以通過全身給藥將藥物運輸到椎間盤，這也使終板軟骨成為減少IVDD的理想藥物靶點〔12，13〕。IL-1β是導致椎間盤終板軟骨炎癥及退變的關鍵致炎因子，既往研究證明IL-1β干預后的軟骨細胞可以出現明顯的Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等ECM主要組成成分的丟失，促進終板軟骨發生退變；而退變的終板軟骨可以進一步成為炎癥介質來源，刺激IL-6、TNF-α等炎性因子大量釋放，引起終板軟骨細胞炎癥，誘導的炎癥可以促進軟骨退變，引起椎間盤退變的級聯反應〔8，14〕。研究認為可以使用IL-1β干預模擬體內終板軟骨蛻變環境，建立終板軟骨細胞體外退變模型〔8，15，16〕。MMPs及ADAMTS5是裂解蛋白聚糖的兩大主要家族之一，其在終板軟骨退變過程中起關鍵作用〔17～20〕。NF-κB信號通路是一類調控細胞免疫、炎癥、生長、凋亡的信號通路，廣泛參與人體生物學過程。在未激活的情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合形成二聚體；當人體受到刺激時，IκB的激酶IκK可以激活IκB，使NF-κB從二聚體中解放并進入細胞核內，促進相關基因轉錄〔16，21〕。研究顯示在退變的終板軟骨細胞中，NF-κB呈明顯高表達；而逆轉NF-κB信號通路時，軟骨退變顯著降低〔22〕。

本研究結果提示合適濃度的(0.1、0.5、1.0 mmol/ml)青藤堿可以顯著促進大鼠椎間盤終板軟骨細胞增殖活力(P<0.05)，但濃度過高的(5.0 mmol/ml)青藤堿會抑制軟骨細胞活力。隨后以IL-1β干預建立椎間盤軟骨退變模型，結果提示IL-1β誘導可以刺激終板軟骨細胞產生炎癥及退變，與研究〔8，15〕結果類似，說明造模成功；本研究結果說明青藤堿可以有效延緩IL-1β誘導終板軟骨細胞炎癥及退變；青藤堿可以通過抑制NF-κB信號通路激活達到治療IL-1β誘導的椎間盤終板軟骨細胞炎癥及延緩軟骨退變的療效。

綜上，青藤堿可以通過阻止NF-κB通路激活而抑制椎間盤終板軟骨細胞炎癥及退變，是一種治療IVDD潛在藥物。