天葵子上調PRKAG2-AS1對膠質瘤細胞增殖、侵襲及遷移的影響

孟召蓮 王振云 高燕

(濟南市中西醫結合醫院 1神經內科，山東 濟南 271100；2中醫內科；3內分泌科)

膠質瘤是中樞神經系統中最具侵略性的腫瘤之一。盡管目前包括外科手術、放射療法和化學療法在內的治療策略已取得進展，但由于復發和轉移，膠質瘤患者的治療效果仍不理想〔1〕。尋找有效抑制膠質瘤轉移的藥物一直是臨床研究的重要課題。天葵子為毛茛科植物天葵的塊狀根莖，主要含有生物堿、香豆精類、內酯等化學成分，具有清熱解毒、消腫散結、利水通淋、敗毒抗癌等作用〔2，3〕。目前，以天葵子為主要成分的中藥復方制劑已廣泛用于食管癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的輔助治療〔4，5〕。既往研究證實，生物堿是天葵子發揮抗腫瘤作用的有效成分，然而天葵子生物堿在膠質瘤中是否具有抗腫瘤作用尚不清楚。本研究通過觀察天葵子生物堿對膠質瘤細胞增殖、遷移侵襲的影響，探討其潛在的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質瘤細胞U251購于中國科學院上海細胞庫；杜氏改良培養基(DMEM)培養基、胎牛血清、Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；小干擾RNA(si-RNA)購于南京金斯瑞生物科技有限公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)購于上海七海復泰生物科技公司；密理博Transwell小室購于北京優尼生物科技有限公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ購于大連TAKARA生物技術公司；細胞裂解緩沖液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Ki67兔單克隆抗體、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗體、神經鈣黏素(N-cadherin)兔多克隆抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG二級抗體購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養 U251細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在含5%CO2的37℃細胞培養箱中培養。當細胞80%融合時加入胰蛋白酶消化，按照1∶3比例轉移至新的培養瓶中培養。

1.2.2天葵子生物堿部位的制備 參考關頻等〔6〕文獻方法獲得天葵子生物堿部位，步驟如下：取30 kg天葵子，95%乙醇煮沸溫浸12 h，70%乙醇煮沸溫浸12 h，重復1次，減壓回收溶劑成流浸膏，得到天葵子乙醇提取物(CT)。用適量水稀釋CT，離心獲得上清液。將上清液上大孔樹脂，分別用水、50%乙醇和95%乙醇洗脫，獲得95%乙醇洗脫物。將洗脫物溶于無水乙醇，過濾除去濾除不溶部分，將得到的洗脫物氧化鋁柱，再次用95%乙醇洗脫，濃縮干燥后即為天葵子生物堿部位。

1.2.3實驗分組 將對數期U251細胞接種96孔板，細胞貼壁后用天葵子生物堿終濃度分別為0、1、10、100 ng/L的DMEM培養基孵育細胞24 h，依次記為對照組、天葵子-L組、天葵子-M組和天葵子-H組。為證實天葵子的抗腫瘤作用與調控PRKAG2-AS1表達有關，利用Lipofectamine2000將si-NC、si-PRKAG2-AS1轉染融合度為50%的U251細胞，48 h后用含100 ng/L天葵子生物堿的DMEM培養基再孵育細胞24 h，依次記為天葵子-H+si-NC組、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組。

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力 每組取2×103個細胞(100 μl)接種到6孔板中，細胞貼壁后，向各孔內添加10 μl的CCK-8溶液，孵育2 h后，酶標儀測量450 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率=A對照組/A實驗組。

1.2.5集落形成實驗檢測細胞克隆能力 每組取5×102個細胞(2 ml)接種到96孔板中，米字型晃動平板使細胞分散均勻。約培養14 d時，用甲醇固定集落，用0.1%結晶紫染色。顯微鏡下計算大于50個細胞的集落數。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 采用孔徑為8 μm的Transwell小室分析U251細胞的遷移和侵襲能力。侵襲實驗時取50 μl的基質膠預先包被Transwell上室膜備用。將室放置在24孔板中，下室加入含有20%胎牛血清的DMEM培養液；收獲不同處理組U251細胞，取200 μl細胞懸液(不含胎牛血清，細胞數約為1×104個)加入到上室中。再培養24 h，棉簽去除上室膜基質膠和未侵襲細胞，隨后用甲醇固定附著在Transwel底部膜的細胞，0.1%結晶紫染色20 min。顯微鏡下隨機選擇6個視野進行計數，以均值表示各組侵襲細胞數。遷移實驗時采用未包被基質膠的Transwell小室，其他步驟同侵襲實驗。

1.2.7實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測PRKAG2-AS1表達 收獲不同處理組U251細胞，Triozl試劑提取細胞總RNA，紫外線吸收法進行定量。PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ進行逆轉錄和RT-qPCR。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算PRKAG2-AS1的相對表達量。PRKAG2-AS1引物上游5′-CTGGGTTCATCAAGGTTTGC-3′，下游5′-GAAGACCCAGAAGTCCCACA-3′。GAPDH引物上游5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.8Western印跡檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 細胞裂解緩沖液裂解各組細胞，收集上清液，紫外線吸收法進行蛋白定量。通過十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離20 mg蛋白樣品，并利用濕法轉膜儀將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫下用含5%脫脂牛奶緩沖液封閉膜4 h，然后與Ki67抗體(1∶1 500)、E-cadherin抗體(1：1 000)、N-cadherin抗體(1∶500)4℃孵育過夜。室溫下用二級抗體(1∶1 000)孵育膜4 h。增強型化學發光試劑顯色，凝膠成像系統分析目的蛋白相對表達量(內參為GAPDH)。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1天葵子對U251增殖的影響 與對照組比較，天葵子-L組U251細胞存活率、克隆形成數變化無統計學意義(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細胞存活率、克隆形成數顯著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間上述指標比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2天葵子對U251遷移侵襲的影響 與對照組比較，天葵子-L組U251細胞遷移和侵襲數無顯著變化(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細胞遷移和侵襲數顯著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間上述指標比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3天葵子對U251中PRKAG2-AS1表達的影響 與對照組比較，天葵子-L組U251細胞PRKAG2-AS1表達無顯著變化(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細胞PRKAG2-AS1表達顯著升高(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間PRKAG2-AS1表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組U251細胞存活率和克隆形成數、遷移侵襲細胞數、PRKAG2-AS1表達比較

2.4干擾PRKAG2-AS1對天葵子作用的U251增殖的影響 與天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組U251細胞存活率、克隆形成數顯著升高(P<0.001)。見表2。

表2 干擾PRKAG2-AS1對天葵子作用的U251細胞 存活率和克隆形成數的影響

2.5干擾PRKAG2-AS1對天葵子作用的U251遷移侵襲的影響 與天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組U251細胞遷移和侵襲細胞數顯著升高(P<0.001)。見表3。

表3 干擾PRKAG2-AS1對天葵子作用的U251遷移 侵襲的影響個)

2.6各個處理組U251中蛋白表達的影響 與對照組比較，天葵子-L組U251細胞Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達變化均無統計學意義(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細胞Ki67和N-cadherin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H三組間上述指標比較差異有統計學意義(P<0.05)。與天葵子-H、天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS組U251細胞Ki67和N-cadherin蛋白表達顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1和表4。

1～6：對照組、天葵子-L組、天葵子-M組、天葵子-H組、天葵子-H+si-NC組、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組圖1 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表4 Western檢測各組細胞處理U251中蛋白的表達

3 討 論

膠質瘤具有高發病率、高復發率和高死亡率特點。至今膠質瘤仍然難以治愈，平均生存時間僅為1年左右〔7〕。本研究從天葵子乙醇提取物對細胞增殖、遷移侵襲的影響和蛋白表達等多方面探討了天葵子的抗腫瘤作用。Ki67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，其表達水平與膠質瘤的惡性程度呈正相關，是檢測癌細胞增殖活性的重要標記〔8，9〕。本研究顯示，中、高劑量天葵子生物堿可顯著抑制U251細胞存活率和克隆形成，抑制Ki67蛋白表達，并呈劑量依賴效應。與本研究結果類似，前人研究顯示天葵子生物堿部位對肝癌細胞BEL-7402、肺癌細胞A-549、小鼠移植性S180肉瘤均有抑制生長作用〔6，10〕。上皮間充質轉化(EMT)是腫瘤的侵襲轉移的重要步驟。通過EMT，上皮細胞失去細胞極性和黏附能力，轉化為間充質細胞，進而獲得侵襲或轉移性表型，抑制EMT可降低細胞的侵襲轉移能力〔11，12〕。本研究結果提示，天葵子生物堿可顯著降低膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，在膠質瘤中具有抗腫瘤作用。長的非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏蛋白編碼能力的長度大于200個核苷酸的轉錄本，其通過在轉錄或轉錄后水平調節基因表達參與調控細胞增殖和侵襲性等惡性行為，其表達失調與腫瘤發生、進展有關〔13，14〕。研究顯示，lncRNA PRKAG2-AS1在肝癌、結腸中表達降低，PRKAG2-AS1可能通過影響PRKAG2表達、抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性進而在腫瘤中發揮抑癌作用〔15，16〕。膠質瘤患者血清中PRKAG2-AS1表達亦顯著降低，PRKAG2-AS1低表達是膠質瘤早期診斷的潛在無創傷性生物標志物〔17，18〕。本研究結果提示天葵子的抗腫瘤作用可能調控PRKAG2-AS1表達有關。通過轉染si-PRKAG2-AS1發現下調PRKAG2-AS1表達可逆轉高劑量天葵子生物堿對U251細胞存活、克隆、遷移侵襲及Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響，恢復U251細胞的增殖、遷移和侵襲能力。以上研究表明，天葵子生物堿對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用可能與上調PRKAG2-AS1表達有關。