阿霉素誘導心力衰竭大鼠腸道菌群改變及益生菌對其NLRP3表達和心功能的影響

王建林 楊麗 史磊

(東營市中醫院 1心內科，山東 東營 257000；2急診科)

炎癥小體是一類存在于胞質內的大分子蛋白復合體，與慢性心力衰竭(CHF)〔1，2〕等心血管疾病密切相關〔3〕。其中Nod樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體是目前研究相對最多的炎癥小體，其激活后可促進炎癥介質表達、釋放，促進CHF發生發展〔4〕。腸道是抵御“外來侵略”的主要屏障，其正常的菌群結構在維持營養、物質代謝等機體生理活動方面發揮重要作用〔5〕。腸道菌群改變在心肌梗死、動脈粥樣硬化、CHF、高血壓等的發生發展中發揮重要作用〔6，7〕。益生菌是一類能夠促進腸道菌群生態平衡，修復腸道屏障，有益于宿主健康的活體微生物〔8〕。益生菌能通過修復腸道屏障控制機體炎癥平衡〔9〕。本研究將使用阿霉素誘導大鼠CHF模型，探討益生菌對CHF大鼠NLRP3表達及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，體質量(250±10)g，購自寧波康泰博科技發展有限公司，許可證號：SYXK(浙)2018-0014。

1.2主要試劑與儀器 阿霉素(貨號：K0091，購自上海寶曼生物科技有限公司)；芪藶強心膠囊(國藥準字Z20040141，購自石家莊以嶺藥業股份有限公司)；益生菌(貨號：WTLS-05552，購自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號：DEM202，購自北京拜爾迪生物技術有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號：DH0006，購自北京雷根生物技術有限公司)；(RIPA)裂解液(貨號：AR0020，購自上海吉至生化科技有限公司)；NLRP3抗體、抗體分泌細胞(Asc)抗體、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抗體、白細胞介素(IL)-1β抗體、IL-18抗體、GAPDH抗體、羊抗兔lgG(貨號：ab263899、ab111852、ab138483、ab200478、ab223293、ab59164、ab205718，購自abcam公司)。

彩色超聲顯像儀(型號：VividE9,購自美國GE公司)；顯微鏡(型號：CKX41SF,購自日本Olympus公司)；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500,購自美國Applied Biosystems公司)；化學發光成像系統(型號：ChemiDocXRS,購自美國Bio-Rad公司)。

1.3分組、造模與給藥 40只大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性組和益生菌組各10只。用0.9%氯化鈉注射液將阿霉素配制成2 mg/ml溶液，模型組、陽性組和益生菌組每只大鼠按照2 mg/kg劑量給予阿霉素尾靜脈注射；同時，對照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液尾靜脈注射，1次/w，連續給藥7 w〔10〕。最后一次給藥12 h后，陽性組按0.32 g/kg劑量灌胃芪藶強心膠囊，益生菌組按5×108CFU/kg劑量灌胃益生菌，對照組、模型組均給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續給藥4 w結束。

1.4超聲心動圖檢測 按3 ml/kg給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射，取仰臥位，胸部備皮，使用彩色超聲顯像儀的10 MHz高頻探頭獲取左心室長軸二維圖像，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于左心室后壁和室間隔，獲得M型超聲心動圖，測定左心室舒張末內徑(LVEDD)和左心室收縮末內徑(LVESD)，計算左室射血分數(LVEF)，取連續3個心動周期的平均值。

1.5qRT-PCR檢測大鼠腸道菌群 收集各組大鼠糞便樣品1～2 g，提取糞便細菌基因組總DNA，利用功能菌群(乳酸桿菌、雙歧桿菌和彎曲桿菌)特異性引物，采用熒光定量PCR儀檢測乳酸桿菌、雙歧桿菌和彎曲桿菌的豐度，結果用細菌拷貝數的常用對數/g糞便表示。

1.6HE染色觀察心肌組織病理形態學改變 處死大鼠，每組取5只大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片，石蠟切片經脫蠟、水化后行HE染色，脫水、透明、封片，使用光學顯微鏡觀察心肌組織病變情況并拍照。

1.7Western印跡檢測心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達情況 取每組剩余5只大鼠心肌組織，用放射性免疫沉淀分析(RIPA)裂解液裂解提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取定量蛋白，并將蛋白變性，進行凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(NLRP3抗體、Asc抗體、caspase-1抗體、IL-1β抗體、IL-18抗體、GAPDH抗體，均1∶500稀釋)，4℃下孵育過夜，TBST洗滌3次，加二抗(羊抗兔，辣根過氧化物酶標記，1∶2 000稀釋)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，顯色曝光，化學發光成像系統拍照，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度，以GAPDH為內參，計算目的蛋白表達量。

1.8統計學分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠超聲心電圖參數 與對照組相比，模型組、陽性組、益生菌組LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，陽性組、益生菌組LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(均P<0.05)；與陽性組相比，益生菌組LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(均P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腸道菌群變化 與對照組相比，模型組、陽性組、益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著降低，彎曲桿菌豐度顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，陽性組、益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著升高，彎曲桿菌豐度顯著降低(均P<0.05)；與陽性組相比，益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著升高，彎曲桿菌豐度顯著降低(均P<0.05)，見表2。

表1 各組LVEDD、LVESD、LVEF比較

表2 各組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、彎曲桿菌豐度及 心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達比較

2.3各組心肌組織病理改變 HE染色顯示，對照組心肌細胞排列整齊，輪廓清晰，未見病理學改變；模型組心肌纖維染色不均，心肌細胞變形、水腫、排列雜亂，細胞核出現碎裂或固縮，心外膜可見炎細胞浸潤；陽性組、益生菌組心肌組織病變程度較模型組均有不同程度的改善，見圖1。

圖1 各組心肌組織病理改變(HE染色，×200)

2.4各組大鼠心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達情況 與對照組相比，模型組、陽性組、益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與陽性組相比，益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 各組心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、 IL-18蛋白表達

3 討 論

阿霉素損害心肌組織具有慢性、蓄積性的優點，已被廣泛用來誘導建立CHF大鼠模型。本研究采用尾靜脈注射的方式使用阿霉素誘導建立CHF大鼠模型〔11〕。人體腸道中含有大量的菌群，其平衡可以協助機體保護腸黏膜屏障，幫助機體吸收分解食物、攝取營養、調節代謝及機體免疫功能，防止病原菌及其有害副產物進入體內〔12〕。腸道菌群的失衡會引起腸黏膜屏障破壞及菌群移位，引起體循環炎癥水平，進而影響機體健康〔13〕。CHF患者腸道菌群紊亂狀態可表現為乳酸桿菌、類桿菌、雙歧桿菌等益生菌數量減少，而沙門菌、彎曲桿菌、志賀桿菌、假絲酵母菌和耶氏森菌等腸道上皮細胞病原菌數量增多〔14〕。本結果提示CHF大鼠腸道菌群已發生明顯改變。益生菌能調控血脂水平，維持大鼠體內部分抗氧化酶活力和非酶抗氧化物質水平，拮抗肝臟脂質過氧化損傷，減輕肝臟炎癥，緩解肝臟受損的程度〔15〕。益生菌可能通過糾正腸道菌群結構紊亂，修復腸道屏障功能及改善腸道內環境，以保護大鼠酒精性肝損傷〔16〕。腸道菌群改變與CHF密切相關，CHF伴發的血流動力學改變可改變腸道通透性、功能及腸道菌群平衡，破壞腸道屏障〔17〕。本研究提示CHF大鼠灌胃益生菌可改善腸道菌群平衡、改善大鼠心功能，有利于大鼠病情好轉。

炎癥反應是CHF發病過程中的重要病理生理機制，其發生貫穿于CHF整個發生發展過程中，可誘導心肌細胞肥大、凋亡及纖維化，促進病情進展〔18〕。NLRP3炎癥小體是目前研究較深入的炎性小體，由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白Asc和caspase-1組成，可調控TNF-α、IL-1β、IL-18等炎癥細胞因子的成熟與分泌，參與絕大多數炎癥反應過程〔19，20〕。張筱琳等〔9〕研究發現，灌胃益生菌產品能夠有效改善慢性腎臟病大鼠腎功能缺失性腸屏障損傷，減輕大鼠體內的系統炎癥現象。本研究提示由NLRP3介導的炎癥反應參與CHF發病過程，而灌胃益生菌可抑制NLRP3介導的炎癥反應。