丹瓜方對HepG2細胞胰島素抵抗模型LKB1-AMPK-ACC信號通路的影響*

楊柳清 李 亮 王思梅 黃蘇萍 王志塔 衡先培△

胰島素抵抗是糖脂代謝紊亂的中心環節，其中肝臟胰島素抵抗最為關鍵。HepG2細胞來源于人肝胚胎瘤細胞，保留了正常肝細胞的基本生物特性，其表面表達高親和力的胰島素受體調控葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類生成等[1]，能較理想地模擬體內葡萄糖代謝環境，是研究胰島素抵抗的理想細胞模型。LKB1-AMPK-ACC信號通路在糖脂代謝中起著關鍵的調控作用。前期研究表明，痰瘀同治的丹瓜方，具有改善糖脂代謝、改善胰島素抵抗，消除高糖的細胞毒性，恢復高糖中細胞生長的正常周期等作用[2-4]。本實驗采用高糖高脂誘導培養HepG2細胞，建立胰島素抵抗模型，予不同濃度的丹瓜方含藥血清干預，并以二甲雙胍含藥血清作為陽性對照，探討丹瓜方對LKB1-AMPK-ACC信號通路的影響。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠，雄性，12周齡，體質量：(220±10)g(購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證編號：SCXK(滬)2012-0002)。環境溫度：(22±1)℃；濕度：50%±5%；12/12 h明暗周期。適應性普通飼料喂養1周，飲食、飲水、活動正常。

1.2 藥物及試劑丹瓜方藥液由丹參、瓜蔞、赤芍、薤白、法半夏、郁金、川芎等組成。制劑由福建中醫藥大學附屬人民醫院藥劑科配制，批號：120928，每毫升含原生藥含量3 g/ml。二甲雙胍藥液：上海信誼藥廠有限公司，批號：國藥準字H31022081。含藥血清的制備：取健康雄性SD大鼠15只，隨機分為丹瓜方組、二甲雙胍組和空白組，分別以6.67 ml/kg丹瓜方藥液、10 ml/kg二甲雙胍藥液及同體積生理鹽水灌胃，于第8天處死，腹主動脈取血。HepG2細胞株(ATCC，USA)。雙抗(Hyclone公司)。軟脂酸(Sigma-Aldrich，USA)。牛血清白蛋白(不含脂肪酸)(北京索萊寶科技有限公司)。BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)。預染蛋白(Marker Thermo，Scientific，USA)。PVDF膜轉印膜(Merck Millipore)。牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要實驗儀器與設備倒置顯微鏡(TS-100F，日本尼康)。自動細胞計數儀(Countstar IC 1000，Countstar)。凝膠成像分析系統(721BR04812，BIORAD公司)。全自動酶標儀，ELX800，美國BioTek公司。凝膠成像分析系統，721BR04812，BIORAD公司。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養將HepG2細胞凍存管37 ℃水浴并融化，將凍存細胞懸液轉移至含新鮮完全培養液的離心管，吹打成細胞懸液后，離心，棄上清，加入培養液重懸，吸取懸液至培養瓶內，置于恒溫培養箱中培養，次日換液，并觀察細胞貼壁情況。當細胞貼壁至80%～90%時傳代，倒置顯微鏡觀察，當細胞間隙增大、回縮近圓形且開始脫落時，轉移細胞懸液于離心管中，離心5 min后棄去上清，加新鮮的培養液并吹打成細胞懸液，按1∶3傳代至含新鮮培養液的培養瓶中，置于培養箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立及模型鑒定

根據前期的實驗基礎[5,6]，本實驗利用0.25 mmol/L PA濃度與4 g/L糖濃度共同體外培養誘導HepG2細胞24 h后成功建立HepG2細胞胰島素抵抗模型。用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖攝取能力鑒定HepG2細胞胰島素抵抗模型。

2.3 含藥血清實驗濃度的篩選將HepG2細胞用胰酶消化后，置于培養箱內培養。待細胞貼壁后，更換無血清培養液繼續培養12 h，加入不同濃度的丹瓜方含藥血清、二甲雙胍含藥血清和空白血清(2.5%，5%，10%，15%)分別干預12 h、24 h、36 h、48 h。與完全培養基組做對照，完全培養基組培養液為89%低糖DMEM培養液、10%FBS和1%雙抗。用酶標儀測量各孔的吸光值。細胞活力(%)=(實驗組OD-空白組OD)/(完全培養基組OD-空白組OD)×100%。篩選出本實驗各含藥血清干預HepG2細胞的適合濃度和適合作用時間。

2.4 實驗分組根據2.3實驗結合分組如下：正常組：HepG2細胞+5%空白血清；溶劑組：HepG2細胞+溶劑溶液+5%空白血清；模型組：HepG2細胞+誘導液+5%空白血清；二甲雙胍組：HepG2細胞+誘導液+5%二甲雙胍含藥血清；5%丹瓜方組：HepG2細胞+誘導液+5%丹瓜方含藥血清；10%丹瓜方組：HepG2細胞+誘導液+10%丹瓜方含藥血清。每組設3個復孔。

2.5 檢測指標及方法

2.5.1 測定各組葡萄糖消耗量及計算胰島素敏感性指數用葡萄糖氧化酶法檢測上清液中葡萄糖殘留量。在酶標儀上測定各孔吸光度，比較各組殘存糖濃度，計算出各組糖耗量和胰島素敏感性指數。根據參考文獻[7]，胰島素敏感性指數(%)=(葡萄糖消耗量實驗組胰島素+-葡萄糖消耗量實驗組胰島素-)/(葡萄糖消耗量正常組胰島素+-葡萄糖消耗量正常組胰島素-) ×100%。

2.5.2 測定各組三酰甘油(TG)按上述2.4實驗分組加入含0.25 mmol/L PA與不同含藥血清的培養基誘導干預24 h后，用三酰甘油測試盒測定TG含量。

2.5.3 Western blot檢測蛋白表達各組LKB1 P-AMPK AMPK P-ACC ACC蛋白表達藥物干預24 h后的HepG2細胞用細胞裂解液裂解后提取總蛋白，檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣品40 μg，最后加預染蛋白Marker 5 μl。經緩沖液處理、蛋白變性、SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用凝膠成像系統進行蛋白條帶顯影及儲存。

3 結果

3.1 不同濃度大鼠血清對HepG2細胞活力影響10%空白血清、丹瓜方含藥血清和二甲雙胍含藥血清干預36 h、48 h細胞存活率顯著降低(P<0.01)，12 h、24 h細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；15%、20%空白血清、丹瓜方含藥血清和二甲雙胍含藥血清干預12 h、24 h、36 h、48 h細胞存活率均顯著降低(P<0.01)?？紤]干預后效果的明顯度，選用5%丹瓜方含藥血清作為干預濃度，10%丹瓜方含藥血清作為梯度對比濃度。見表1～表3。

表1 各組小鼠不同濃度空白血清對HepG2細胞生長活性影響比較

表2 各組小鼠不同濃度丹瓜方含藥血清對HepG2細胞生長活性影響比較

表3 各組小鼠不同濃度二甲雙胍含藥血清對HepG2細胞生長活性影響比較

3.2 各組含藥血清對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量 胰島素敏感指數 TG含量影響模型組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感指數明顯下降(P<0.01)，TG含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組，5%丹瓜方組、10%丹瓜方組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感指數明顯升高(P<0.01)，TG含量明顯下降(P<0.01)。與二甲雙胍組比較，5%丹瓜方組含胰島素的糖耗量、胰島素敏感性指數下降(P<0.05)，5%丹瓜方組不含胰島素的糖耗量、TG含量差異無統計學意義(P>0.05)；10%丹瓜方組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感性指數、TG含量差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠含藥血清對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量 胰島素敏感指數 TG含量影響比較

3.3 含藥血清對胰島素抵抗HepG2細胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表達影響與正常組相比，模型組LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達降低(P<0.01)，ACC蛋白表達增多(P<0.01)；與模型組相比，二甲雙胍組、5%丹瓜方組、10%丹瓜方組LKB1、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達增加(P<0.01)，ACC蛋白表達降低(P<0.01)，AMPKα蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05；##P<0.01。圖1 含藥血清對胰島素抵抗HepG2細胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表達影響

4 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖和動脈粥樣硬化等臨床疾病的共同危險因素。LKB1-AMPK-ACC信號通路與胰島素抵抗密切相關。AMPK是一種重要的蛋白激酶，是調節細胞能量代謝的感受器，最重要的功能是調節葡萄糖和脂肪代謝，它可以增強胰島素的敏感性，減少肝糖的輸出[8]。研究發現，AMPK基因剔除可誘導小鼠胰島素抵抗，AMPK過表達或AMPK特異性激活劑均具有胰島素增敏效應[9]。LKB1是AMPK的上游激酶之一[10]，研究證實肝細胞中的LKB1有助于磷酸化AMPK，LKB1缺失可使AMPK功能下調。這說明在糖異生過程中，LKB1是AMPK信號通路的一個關鍵的靶分子，誘導的LKB1能夠通過控制AMPK在組織中的表達影響AMPK下游的通路。ACC是AMPK的下游靶點之一，是脂肪酸合成的限速酶，AMPKα的磷酸化對ACC活性的調節起重要作用，AMPKα的活化促進ACC磷酸化，從而抑制ACC，ACC被AMPK磷酸化后失去活性，增強了脂肪酸氧化作用，使脂肪酸及TG合成減少，因此，細胞內ACC磷酸化水平上調則被作為AMPKα活化的標志[11-13]。因此本研究以LKB1-AMPK-ACC信號通路為切入點，探討丹瓜方改善糖脂代謝和胰島素抵抗的機制。

本實驗結果表明與正常組相比，模型組LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達明顯降低(P<0.01)，ACC蛋白表達顯著增多(P<0.01)，提示LKB1-AMPK-ACC信號通路在HepG2細胞胰島素抵抗模型表達異常，進而影響葡萄糖和脂肪的代謝。二甲雙胍是臨床上常用的降糖藥物，研究表明，二甲雙胍調節糖脂代謝的分子機制與AMPK信號通路密切相關。二甲雙胍通過LKB1顯著增加AMPKα1亞基的磷酸化。文獻報道在LKB1基因敲除高脂飲食胰島素抵抗的小鼠中，二甲雙胍不降低血糖[10]，說明二甲雙胍通過激活LKB1-AMPK信號通路，使AMPK磷酸化，參與多個體內能量代謝途徑，包括后續使ACC磷酸化后失活而促進脂肪酸氧化，減少脂肪的合成[14，15]，繼而抑制肝臟的糖異生，改善胰島素敏感性，降低血糖水平[16]。本實驗結果顯示，5%丹瓜方組、10%丹瓜方組與二甲雙胍組相比，LKB1、P-AMPKα、P-ACC、ACC蛋白表達差異無統計學意義。提示丹瓜方顯著增加LKB1、P-AMPKα蛋白的表達，上調ACC的磷酸化水平，抑制ACC蛋白的表達，丹瓜方改善胰島素的敏感性的機制與二甲雙胍相似，都與調控LKB1-AMPK-ACC信號通路有關。

中醫認為痰濁、瘀血既是胰島素抵抗的病理產物，也是進一步導致“變證”“壞證”的病因。因此，解決痰瘀互結對改善胰島素抵抗有著至關重要的作用。丹瓜方是基于痰瘀互結的基本病機，立足于痰瘀同治的方劑。本研究結果表明，丹瓜方含藥血清可以增加高糖高脂誘導的HepG2細胞抵抗模型的葡萄糖攝取能力，改善胰島素敏感指數，降低細胞內TG含量，其中10%丹瓜方組與二甲雙胍組作用效果相當，優于5%丹瓜方組。由此可以看出，以活血化瘀祛痰之法組成丹瓜方復方，其作用相互協同，共同起到增加葡萄糖消耗量，提高胰島素敏感性，降低細胞內TG沉積，從而起到改善胰島素抵抗的作用，且其作用存在劑量依賴關系。

綜上所述，丹瓜方可改善HepG2胰島素抵抗模型細胞糖脂代謝和胰島素抵抗，其調控的糖脂代謝的分子機制為調控LKB1-AMPK-ACC信號通路。但是丹瓜方調控LKB1-AMPK-ACC信號通路的機制尚未完全闡明，有待進一步的深入研究。