槲皮素通過抑制氧化應激改善3×Tg-AD小鼠的認知功能障礙

楊宜歆，時 磊，趙 楊，王延虹，李艷艷

（鄭州大學第五附屬醫院 鄭州 450052）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一種難以治愈的神經退行性疾病，患者的認知功能受到嚴重的影響，伴隨不可逆的記憶喪失，逐漸喪失自我照顧管理的能力[1]。AD 的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑和Tau蛋白過度磷酸化形成的神經元纏結[2-3]，且有研究表明Aβ 寡聚體具有較強的神經毒性，可以通過多種機制介導突觸功能和數量異常，引起神經元死亡[4]。我國AD 患者人數逐年升高，發病率約為6.25/1000 人/年，且增速約為西歐和其他高水平地區的3 倍[5]。AD 是全球重要的公共衛生問題，給患者的家庭和社會帶來巨大的負擔。由于缺乏對AD 發病機制的了解，迄今尚沒有逆轉或阻止AD 病情進展的有效治療藥物。因此，深入探究AD 的發病機制，尋找潛在的治療藥物是亟需解決的問題。

越來越多的研究認為，氧化應激是導致衰老和包括AD 在內的多種神經退行性疾病發展的重要因素[6-7]。ROS 的產生與抗氧化防御之間的平衡是正常細胞功能所必需的。然而，在AD 中，抗氧化酶的活性受到抑制，氧化與抗氧化之間的平衡被打破，從而導致氧化損傷的無限制積累，最終引起細胞損傷[8]。

槲皮素（Quercetin，QT）是一種黃酮類化合物，廣泛存在于蘋果、漿果、洋蔥和鯉魚等許多水果和蔬菜中[9]。多項研究表明，槲皮素能發揮神經保護作用，對抗氧化應激。有研究表明，口服槲皮素（50 mg·kg-1）可以減輕被迫參與強迫游泳實驗的大鼠海馬和紋狀體內氧化應激的增加[10]；Tang等人的研究表明，槲皮素可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥和氧化應激[11]。

3×Tg-AD 小 鼠 是 由 Oddo 等 人 建 立 的 含 PS1（M146V）、APP（Swe）和Tau（P301L）基因的三重轉基因模型純合子小鼠，小鼠可正常存活并具有生育能力，無先天性缺陷或異常行為[12]。該模型小鼠具有AD的主要病理學特征，β 淀粉樣蛋白形成的斑塊以及過度磷酸化形成的神經元纏結，并且這些病理特征在6月齡時就較為明顯，是一種理想的AD動物模型[13]。因此我們選用3×Tg-AD 小鼠作為AD 的動物模型，深入探討AD 的發病機制以及槲皮素在AD 中可能的作用，為AD 的發病機制提和槲皮素在AD 的中的潛在治療作用提供新的證據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

將9 月齡的3×Tg-AD 小鼠和其同窩野生型對照小鼠隨機分為4 組：野生型組（wildtype，WT）、野生型+QT 組（WT + QT）、模型組（3×Tg-AD）和模型小鼠+QT組（3×Tg-AD + QT），每組8 只。WT + QT 組和3×Tg-AD + QT 組的小鼠灌胃給予 QT 15 mg/kg/天，WT 組和3×Tg-AD 組的小鼠灌胃給予等體積溶劑，共治療8周。第7 周進行行為學測試，在此期間繼續給予如前藥物治療。

小鼠飼養在SPF 級動物房間，飼養溫度為（25 ±2）°C，相對濕度約50%，明暗周期為12 h，可自由飲食飲水，定期更換墊料。對于實驗動物進行的所有操作都遵守倫理規定，并經過本院實驗動物管理和使用委員會的批準。

1.2 主要儀器及試劑

Morris水迷宮系統（北京眾實），電子天平（賽多利斯）；電泳儀、電泳槽和轉膜槽（美國Bio-Rad 公司）；化學發光成像儀（賽默飛，Invitrogen iBright）；多功能酶標儀（賽默飛，VarioskanLUX）；離心機（德國艾本德）。槲皮素（≥97%）購自于上海源葉生物科技有限公司；丙二醛（MDA）測試盒（A003-1-2）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3-2）、一氧化氮（NO）測試盒（A012-1-2）和谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（A005-1-2）均購自于南京建成生物工程研究所。小鼠白介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附測定試劑盒（EEL-M0037c）和小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附測定試劑盒（E-EL-M3063）購自于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。Nrf2 抗體（16396-1-AP）、Keap1抗體（10503-2-AP）、β-actin（66009-1-lg）、HRP標記的羊抗兔IgG（SA00001-2）和HRP 標記的羊抗鼠IgG（SA00001-1）均購自于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水迷宮實驗

水迷宮實驗設備選用Morris 系統小鼠通用型設備，水池直徑100 cm，深50 cm，水深25 cm，水溫控制在22-24°C，水中加入白色染料，在水池壁的四個方向均勻設置不同的標記，使得水池被等分為四個象限。將直徑6 cm的平臺放置于第三象限水下2 cm處。

定位航行實驗：將待測小鼠依次從四個象限入水點放入水中，記錄小鼠60 s內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果小鼠在60 s內未找到平臺，逃避潛伏期即為60 s；如果小鼠在60 s內找到平臺，那么到達平臺的時間即為小鼠的逃避潛伏期。逃避潛伏期的長短可以評價小鼠的空間學習能力。

空間探索實驗：定位航行實驗結束24 h 后，撤去平臺，在第一象限相同的入水點將小鼠背向平臺之前所在象限放入水中，記錄小鼠在60 s 內穿越原平臺的次數，以此評價小鼠的空間記憶能力。

1.3.2 血清中MDA、SOD和GSH-Px的含量

收集各組小鼠血液于抗凝管中，4°C、3000 rpm 離心5 min 分離血清與血細胞，根據試劑盒說明書步驟操作，檢測各組血清中MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.3.3 ELISA檢測IL-1β、TNF-α的含量

取適量小鼠腦組織于玻璃研磨器中研磨，加入預冷的生理鹽水，制成10%的組織勻漿液，4°C、12000 rpm 離心10 min 收集上清，根據ELISA 試劑盒說明書進行操作，計算各組小鼠腦組織中IL-1β 和TNF-α 的含量。

1.3.4 NO含量檢測

取上一步收集的腦組織上清，采用Griess 方法參照NO 試劑盒說明書進行操作，根據標準曲線計算得到各組樣本中NO的含量。

1.3.4 Western Blot檢測炎癥通路蛋白

取小鼠腦組織于電子天平上稱重后，置于玻璃研磨器中研磨，加入預冷的生理鹽水，制成10%的組織勻漿液，于 4°C 離心機中 12000 rpm 離心 10 min，取沉淀物加入蛋白裂解液（每0.1 g 組織加入140 μL 裂解液），冰上裂解40 min，每10 min在渦旋儀上渦旋一次。于 4°C 離心機中 14000 g 離心 10 min，上清即為蛋白原液。BCA 試劑盒進行蛋白濃度定量，加入buffer 高溫使蛋白變性后，分裝保存于-20°C。

配制適宜濃度的SDS 凝膠，電泳，轉膜，分割PVDF 膜，得到目的蛋白和內參條帶，5%的脫脂奶粉室溫下于 30 rpm 搖床上孵育 2 h 進行封閉，4°C 孵育Nrf2 一抗（1:1000）、Keap1 一抗（1:1000）或 β-actin 一抗（1:1000），過夜。TBST 洗膜3 次，10 min/次，之后與HRP 標記的二抗（1:1000）于室溫條件孵育2 h，TBST再次洗膜3 次，10 min/次。在膜上均勻滴加ECL 發光液后置于凝膠成像儀中拍照，圖片使用Image J 2.0 進行灰度值計算。

1.4 統計分析

實驗結果以平均值 ± 標準差（mean ± SD）表示。采用one-way ANOVA 方差分析進行數據統計，任意組間差異使用Kruskal-Wallis 多重比較檢驗法進行分析，p＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 槲皮素改善3×Tg-AD小鼠的學習能力

在為期4 天的水迷宮訓練中，各組小鼠都表現出一定的學習能力，隨著訓練時間的增加，各組小鼠的逃避潛伏期降低（圖1A）。實驗結果表明，與WT 組小鼠相比，3×Tg-AD 組小鼠逃避潛伏期降低的較慢，而3×Tg-AD+QT組小鼠的逃避潛伏期顯著降低，二者之間的差異具有統計學意義（圖1B）。

圖1 槲皮素改善3×Tg-AD小鼠的學習能力

2.2 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠的空間記憶能力

在水迷宮訓練結束的24 h 后，撤去平臺。3×Tg-AD 組小鼠的穿越虛擬平臺次數明顯低于WT 組小鼠，而3×Tg-AD+QT 組小鼠穿越虛擬平臺的次數顯著增加（圖2），二者之間的差異具有統計學意義，說明槲皮素可以提高3×Tg-AD小鼠的空間記憶能力。

圖2 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠的空間記憶能力

2.3 槲皮素降低3×Tg-AD小鼠腦內氧化應激水平

與WT 組小鼠相比，3×Tg-AD 組小鼠血清中MDA含量升高（圖3A），SOD 和GSH-Px 含量明顯降低（圖3B 和3C），說明3×Tg-AD 組模型小鼠腦內應激水平明顯增加；而3×Tg-AD + QT 組小鼠血清中MDA 含量顯著降低（圖3A），SOD 和GSH-Px 含量顯著升高（圖3B、圖3C），說明槲皮素可以抑制3×Tg-AD 模型小鼠腦內氧化應激水平。

圖3 槲皮素抑制MDA水平，提高SOD與GSH-Px的水平

2.4 槲皮素降低3×Tg-AD 小鼠腦組織中NO、IL-β、TNF-α的水平

3×Tg-AD 組小鼠腦組織勻漿上清中NO（圖4A）、IL-β（圖4B）、TNF-α（圖4C）的水平與WT 組小鼠相比均明顯升高；而3×Tg-AD + QT 組小鼠腦組織中這些炎癥因子的水平均明顯降低，說明槲皮素可以抑制3×Tg-AD小鼠腦組織中炎癥反應水平。

圖4 槲皮素降低模型小鼠腦組織中NO、IL-β、TNF-α的水平

2.5 槲皮素上調3×Tg-AD 小鼠腦部Nrf2 的表達，抑制Keap1的表達

Western blot 實驗結果表明，與WT 組相比，3×Tg-AD組小鼠腦組織中Keap1表達量顯著升高，而Nrf2含量顯著降低，從分子層面進一步證實3×Tg-AD 模型小鼠腦內發生氧化應激（圖5）；而3×Tg-AD + QT 組中，Keap1 的表達被抑制，Nrf2 的含量升高，提示槲皮素可能通過調節Nrf2/Keap1 途徑改善3×Tg-AD 小鼠氧化應激水平（圖5）。

圖5 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠腦部Nrf2的水平，降低Keap1的表達

3 討論

AD 的治療在臨床上進展緩慢，主要原因是AD 發病機制目前尚未被闡明。學者們提出了許多關于AD的假說，如Aβ 沉積形成老年斑、Tau 蛋白過度磷酸化導致神經元纏結等。近些年來，越來越多研究結果表明，氧化應激在AD 的發病機制中起著重要作用。機體在受到有害刺激時，ROS 及活性氮（RNS）等自由基過度堆積，機體內氧化與抗氧化之間的動態平衡被打破，表現為SOD 活性下降和/或MDA 含量升高，體內氧化/抗氧化平衡失調會引起信號傳導通路異常激活，誘導細胞凋亡，引起組織損傷。李瑞天等人的研究表明，AD 患者血清中 SOD 和 GSH-Px 水平降低，MDA 顯著升高[14]。同樣的，趙仲艷等人的研究結果顯示，AD患者中存在明顯的氧化應激和自由基損傷的現象[15]。說明氧化應激在AD 的病理過程中可能發揮著重要的作用。我們的研究結果表明，3×Tg-AD 小鼠血清中MDA 水平升高，SOD 和 GSH-Px 水平降低，說明在 AD模型小鼠中發生了明顯的氧化應激，這與其他學者前期的研究結果相吻合。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，存在于許多水果和蔬菜中。蘋果、櫻桃、漿果、洋蔥、蘆筍和紅葉萵苣中槲皮素含量最高[16]。關于氧化應激在神經退行性病變中的關鍵作用，人們普遍認為調節自由基的產生或減輕其有害影響可被作為預防和控制神經退行性疾病的一種潛在的治療策略[17]。Wang 等人的研究表明，槲皮素可改善APPswe/PS1dE9 轉基因小鼠模型的學習記憶和認知記憶，減少散在的老年斑形成，減輕線粒體功能障礙，表現為增加線粒體膜電位和ATP 水平，同時減少活性氧(ROS)的產生[18]。在Chen,Z.等人的研究中表明抗氧化劑可能有益于AD 的治療[19]。Chen 等人發現 QT 可以降低 IRE1α 和 PERK 的磷酸化水平來抑制內質網應激，最終減弱SH-SY5Y 細胞中Tau 的磷酸化水平[20]；Liu 等人使用聚山梨酯 80 修飾QT，發現修飾后的QT 可以激活SH-SY5Y 細胞的自噬，促進自噬體和溶酶體的融合，加速Aβ 的清除，保護SH-SHY5Y 細胞免受Aβ 誘導的細胞毒性損傷[21]；Sun 等人的研究結果表明，納米QT 可以抑制Zn2+-Aβ 42 系統的神經毒性，提高神經元活力，并且可以改善APP/PS1 小鼠的認知和記憶障礙[22]。我們的研究結果表明，3×Tg-AD + QT 組小鼠的逃避潛伏期明顯低于3×Tg-AD 組小鼠，且在撤去平臺之后，穿越平臺次數也顯著高于3×Tg-AD 組小鼠，說明槲皮素具有治療AD 的潛在藥理作用。同時3×Tg-AD + QT 組小鼠血清中 MDA 水平降低，SOD 和 GSH-Px 水平升高，說明槲皮素具有良好的抗氧化作用。

炎癥是包括神經退行性疾病在內的多種疾病的一個主要特征，在AD 腦部存在明顯的炎癥現象，炎癥造成的直接和間接損害會加劇AD 的發生和發展。因此，抑制炎癥可能有助于減緩這種破壞性疾病的進展或延緩其發病[23-24]。超過15 項流行病學研究表明，非甾體抗炎藥物在AD 中具有保護作用。這些流行病學有一個一致的發現，非甾體抗炎藥在臨床診斷前使用的時間越長，保留的效果就越大[25]。因此，抑制炎癥可能成為治療AD 的主要策略。Wang 等人的研究表明，槲皮素對心肺復蘇大鼠模型的炎癥有明顯的抑制作用[26]。Chen 等人的研究發現槲皮素可通過阻斷NF-κB 和 AP-1 信號通路，抑制腫瘤壞死因子-κ 誘導的細胞凋亡和炎癥反應，從而發揮治療冠心病的作用[27]。我們的研究結果顯示，3×Tg-AD 組小鼠腦組織中NO、TNF-α、IL-1β 水平較WT 組均明顯升高，而3×Tg-AD+ QT 組小鼠NO、TNF-α、IL-1β 較3×Tg-AD 組均明顯下降，說明槲皮素可以抑制3×Tg-AD 組小鼠腦組織中炎癥反應的發生。

Nrf2 介導的信號通路是機體內維持氧化應激、氧化還原平衡的重要信號通路。Nrf2 是負責調節機體抗氧化應激反應過程的核轉錄因子，能夠通過與胞漿蛋白Keap1相互作用，誘導相關基因差異表達，包括具有抗氧化、抗炎及生物轉化酶等功能的基因[28]。Nrf2被稱為抗氧化反應的“主調節因子”，調控著數百個基因的表達，其中不僅包括常見的抗氧化酶，還包括大量控制免疫和炎癥反應、組織重塑和纖維化、癌變和轉移、甚至認知功能障礙和成癮行為等不同過程的基因[29]。在一項研究中發現，AD 患者中存在氧化應激的現象，并且Nrf2 的表達水平下降[30]。甄蓉蓉等人的研究表明，地黃益智方可能通過調控Nrf2/ARE 信號通路抑制APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬神經元凋亡[31]。王珊等人的研究表明，Nrf2/HO-1 通路下調參與了Aβ 誘導的氧化應激損傷，丹皮酚可以通過激活該通路對AD起到神經保護作用[32]。我們的研究表明，3×Tg-AD 組小鼠腦組織中Nrf2 表達水平降低，而Keap1 的表達水平升高，說明3×Tg-AD 組小鼠腦部氧化/還原平衡被打破。3×Tg-AD+QT組小鼠腦組織中Nrf2表達增多，與之對應的是Keap1表達下降。

我們的研究結果表明，QT 可以降低9 月齡3×Tg-AD 小鼠血清中 MDA 水平，升高 SOD 和 GSH-Px 水平；抑制炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β 的產生；上調Nrf2 的表達，降低Keap1的表達。但是QT如何通過氧化應激途徑改善3×Tg-AD 小鼠的認知功能障礙，還需要進一步的探討。綜上，我們的研究采用3×Tg-AD 小鼠作為槲皮素防治AD 的動物評價模型，初步探討了槲皮素在AD 中的作用與可能的機制。槲皮素可能通過調節Nrf2/Keap1 通路，改善氧化/還原失衡的狀態，抑制腦內炎癥反應從而改善3×Tg-AD小鼠的認知功能障礙。

本工作的主要創新點主要有以下兩點，首先動物模型選擇了3×Tg-AD 小鼠，3×Tg-AD 小鼠是一種理想的探索AD 的動物模型，其具有3 個突變等位基因，純合子可存活并具有生育能力，無明顯天生缺陷或異常行為。其次探討了槲皮素在3×Tg-AD 小鼠中對氧化應激水平和氧化應激相關通路的影響，為將槲皮素開發成為防治AD的藥物的提供新的證據。