面向隱結構模型和網絡藥理學探討“調肝守恒、化濁解毒”治療慢性胃炎的潛在生物學機制＊

徐偉超 ，李博林 ，賈文文 ，李佃貴 ，劉建平 ，郎曉猛 ，杜 姚 ，才艷茹 ，杜朋麗 ，趙丹陽 ，楊 倩 ＊＊

（1. 河北省中醫院 石家莊 050011；2. 河北省中西醫結合胃腸病研究重點實驗室 石家莊 050011）

慢性胃炎患者多數并無癥狀，難以獲得精準、確切流行病學資料，目前我國基于內鏡診斷的慢性胃炎患病率已接近90%，推測患者數以億計[1]。慢性胃炎患者的胃癌、腸道腫瘤、胰腺癌患病率均較一般人群增高，具有較高癌變風險[2]。慢性胃炎伴上皮內瘤變是其典型代表，癌變率達0.25%-6%[3]，成為危害我國人民身體健康和降低生活質量的主要慢性疾病之一。幾千年臨床實踐證明，運用祖國醫學“人病共存”“以平為期”先進理念與方法學治療慢性疾病優勢明顯。慢性胃炎多歸屬于中醫“胃痛”“胃痞”“吐酸”“嘈雜”等范疇，以癥狀診斷命名，分為本虛、標實兩種病機，多從氣機、濕熱、氣虛、陰虛、瘀血等方面論治，形成了諸多名老中醫特色用藥與診療經驗[4]，如何正確詮釋名老中醫治療經驗，快速、有效明確慢性胃炎中藥藥效物質基礎及可能靶點，成為中醫藥有效治療慢性胃炎亟待解決的科學問題之一。

作為數據分析的經典方法之一，隱結構模型在中醫臨證梳理中具有重要的數據量化與詮釋作用，有廣闊的應用前景[5]。團隊前期運用隱結構模型分析方法（圖1），詮釋研究團隊“調肝守恒”治法，方證結合：香附、白芍、川芎、延胡索、黃連、白術、豆蔻、藿香、半枝蓮、白花蛇舌草等組成，具有調肝守恒、化濁解毒之功，用于胃脘痞悶、疼痛、噯氣、納呆、口干口苦、大便粘膩不爽等。團隊前期基礎已證實，該治法組方對多種脾胃疾病具有很好的臨床療效[6-7]。

網絡藥理學集合整體、動態、分析于一體，是融合系統生物學、藥理學、中藥藥理學、分子生物學、計算機學為一體的新興交叉學科，可構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”多層生物信息網絡，揭示疾病-藥物隱性關系。對于中藥復方可提供多層次、多成分、多靶點的研究視角，為中醫藥經驗醫學的可視化、數據化研究提供方法學支持[8-9]。“調肝守恒”治法作為面向隱結構模型挖掘結合名老中醫經驗詮釋的創新治法，目前還未見到相關網絡藥理學研究報道。如何從大規模、復雜的多維臨床數據中發現較優的中醫治療方劑，并分析方劑可能的作用機制，成為臨床策略形成與驗證的重要課題，也是辨證論治臨床評價研究的關鍵問題。隱結構模型和網絡藥理學的結合，可以較好地模擬、優化、驗證中醫治療方劑，提高臨證經驗數據分析詮釋準確性。本研究采用隱結構模型詮釋名老中醫思維決策，結合網絡藥理學搜索“調肝守恒”治法化合物和靶標蛋白，構建與分析靶標網絡，篩選核心靶標，進行功能富集，探討創新治法防治慢性胃炎潛在分子機制，以期為“調肝守恒-慢性胃炎”的臨床評定實踐提供部分可視化數據支持，研究方案見圖2。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 組方有效成分的篩選

根據調肝守恒處方組成與《中國藥典》2015 版[10]的藥物規范名稱，由香附（CYPERI RHIZOMA）、白芍（PAEONIAE RADIX ALBA）、川 芎（CHUANXIONG RHIZOMA）、延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、黃連（COPTIDIS RHIZOMA） 、白 術 （ATRACTYLODIS MACROCEPHALAE RHIZOMA） 、 豆 蔻 （AMOMI FRUCTUS ROTUNDUS）、藿 香（POGOSTEMONIS HERBA） 、半 枝 蓮 （SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA）、白花蛇舌草（HEDYOTIS DIFFUSA WILLD）、三七（NOTOGINSENG RADIX ET RHIZOMA）、茯苓（PORIA）、百合（LILII BULBUS）、枳實（AURANTIIFRUCTUS IMMATURUS） 、木 香 （AUCKLANDIAE RADIX）、砂仁（AMOMI FRUCTUS）組成。檢索TCMSP數據庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[11]收集組方主要化學成分。按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，藥物半衰期（HL）≥8（百合和砂仁為≥6）為條件從上述數據庫中篩選出具有較高活性且可能入血的成分。

1.1.2 組方有效成分靶點的收集

利用TCMSP 數據庫中的Related Targets 預測成分相關靶點；通過UniProt 數據庫[12]（https://www.uniprot.org/）預處理靶點名稱，得到最終中藥活性成分相關靶點。

1.1.3 慢性胃炎相關靶點獲取

利用GeneCards 數據庫[13]（https://www.GeneCards.org/）對慢性胃炎相關靶點進行篩選。應用Uniprot 數據庫對疾病靶點進行靶點-人類基因名轉換后將組方主要活性成分的預測靶點與慢性胃炎相關靶點進行交集并繪制韋恩圖，提取共同的靶基因。

但，在今天，傳統文化也許被很多人所遺忘。試問，如今聽說評書的人有多少？學習傳統戲曲的又有多少？隨著一代又一代大師的離去，真正懂這些的人還有多少？是的，正因如此，人們才會有著再無“且聽下回分解”的遺憾。

1.1.4 中藥-活性成分-靶點網絡構建及分析

為了更清晰的展現藥物-成分-疾病靶點之間的關系，運用Cytoscape 軟件[14]構建“中藥-活性成分-疾病靶點”的可視化網絡圖。在網絡中，節點表示中藥、活性成分、疾病靶點。邊則代表了中藥、活性成分、疾病靶點之間的相互作用關系。節點的重要程度根據自由度（Degree）進行分析。

1.1.5 靶點蛋白互作網絡構建及關鍵靶點篩選

利用String 在線數據庫[15]（https://String-db.org/）分析靶點的蛋白間相互作用（protein protein interaction，PPI），靶點信息錄入數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，篩選蛋白互作綜合得分＞0.4作為篩選條件得到PPI 信息，將信息導入Cytoscape 軟件，進行網絡拓撲分析，根據Degree的數值，篩選出核心靶基因。

1.1.6 生物功能注釋（GO）基因分析與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析

利用Cytoscape 軟件Clue GO 插件對作用靶點進行 GO 和 KEGG 富集分析，保留P≤0.05 結果，得到可視化圖片。

2 結果

2.1 網絡藥理學預測

2.1.1 組方中藥活性成分篩選

基于OB≥30%，DL≥0.18，HL≥8（百合、砂仁為HL≥6）作為條件對方中藥物進行活性成分篩選，得到59個活性成分。

2.1.2 組方中藥活性成分篩選慢性胃炎相關靶點

從TCMSP 數據庫中的Related Targets 預測得到232 個成分相關靶點，從GeneCards 數據庫中檢索“慢性胃炎”相關靶點，得到1139 個疾病相關靶點。然后將232 個成分靶點與1139 個慢性胃炎靶點進行韋恩圖繪制（圖3）；計中和靶點101個。

圖3 組方與慢性胃炎重合的靶點韋恩圖

2.1.3 藥物活性成分-靶點網絡建立、分析

根據藥物中篩選的活性成分和作用于疾病的相關靶點，利用Cytoscape 軟件構建藥物活性成分-靶點網絡，紅色代表基因，用不同顏色表示該成分來源自某一種藥物，例如黃色表示來自黃連、粉色表示來自白術、綠色表示枳實等，經過數據分析，發現茯苓、延胡索、百合三種藥物的成分所對應的靶點與疾病無交集，所以在成分和靶點圖中沒有上述三種藥物（圖4）。藥物活性成分中“Degree”值排前7 的分別是：槲皮素（Quercetin，MOL00098）、木 犀 草 素（Luteolin，MOL000006）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、漢黃芩 素（Wogonin，MOL000173）、黃 芩 素（Baicalein，MOL002714）、川陳皮素（Nobiletin，MOL005828）、柚皮素（Naringenin，MOL004328）。

圖4 組方活性成分-靶點圖

2.1.4 靶點PPI 網絡分析及關鍵靶點的篩選

基于String在線數據平臺上輸入疾病-處方101個中和靶點，分析后得到PPI 網絡圖（圖5）。圖中含有101個靶蛋白和1783條互作邊。推測組方治療慢性胃炎可能與蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1/3（MAPK1/3）等靶標有關。

圖5 組方與慢性胃炎蛋白質相互作用核心網絡圖

2.1.5 作用靶點的GO富集分析

作用靶點的GO（Gene Ontology）富集分析包含生物過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）。利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對101 個共同作用靶蛋白進行GO 生物功能注釋，根據保留P≤0.05 的結果，并分別對前20 個數據進行可視化分析，得到（BP,CC,MF）柱狀圖，其中縱坐標表示富集條目，橫坐標表示富集個數（圖6～圖8）。圖6 顯示疾病-處方共同作用靶點在BP 中，主要富集條目為對金屬離子的反應（response to metal ion）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）、脂多糖應答（response to lipopolysaccharide）、對細菌來源分子的反應（response to molecule of bacterial origin）及對抗生素的反應（response to antibiotic）等。圖7 顯示示疾病-處方共同作用靶點在CC 中，主要富集條目為囊腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細胞質囊 腔（cytoplasmic vesicle lumen）、膜 筏（membrane raft）、膜微區（membrane microdomain）等。圖8 顯示疾病-處方共同作用靶點在MF 中，主要富集條目為磷酸酶結合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding）、抗氧化活性（antioxidant activity）、支架蛋白結合（scaffold protein binding）等。

圖6 組方主要作用靶點的BP柱狀圖

圖7 組方主要作用靶點CC柱狀圖

圖8 組方主要作用靶點MF柱狀圖

2.1.6 KEGG通路富集分析

將得到的通路條目、靶點信息導入Cytoscape 軟件，繪制得到靶點-通路圖（圖9）。其中紅色代表通路，綠色代表靶點，形狀越大代表富集越顯著。MAPK信號通路、AKT 信號通路等與組方治療慢性胃炎的潛在靶標密切相關，體現了組方多成分、多靶點多通路對慢性胃炎起到綜合治療作用。

圖9 組方作用靶點-通路圖

3 討論

我們在前期研究中發現運用多種中醫治法能改善慢性胃炎中醫證候療效，提高患者生活質量，影響血清腫瘤特異性生長因子、胃癌單抗MG7 相關抗原，降低血清炎癥因子水平[16，17]，但中藥復方藥物眾多，成分復雜，效用協同，分子機制并未闡明，故研究借助網絡藥理學對驗方作用機制進行探索性研究，結論如下：

3.1 主要成分分析

篩選出組方59 種主要活性成分和101 個成分靶點。最主要的活性成分為槲皮素（Quercetin，QT）、木犀草素（Luteolin，Lut）、山柰酚（Kaempferol，Kae）、漢黃芩 素（Wogonin）、黃 芩 素（Baicalein）、川 陳 皮 素（Nobiletin）、柚皮素（Naringenin）。QT 作為一種天然飲食類黃酮，富含于絕大多數植物類中藥中，具有明顯的抗氧化、抗炎作用[18]。有研究者發現，QT 可通過c-Jun/ATF2/Bcl-x L 途徑增強5-氟尿嘧啶對胃癌細胞線粒體途徑凋亡的誘導活性[19]。Lut 是主要存在于中藥中的天然黃酮類化合物，有一定的免疫調節、抗癌、抗氧化作用[20]，有學者發現，Lut可通過HIF-1α抗胃癌細胞增殖和遷移[21]。Kae 是一種富含在化濕類中藥中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等功效[22]，有研究者發現，Kae 通過激活IRE1-JNK-CHOP 信號通路誘導胃癌細胞自噬[23]。漢黃芩素具有抗腫瘤、神經保護、抗病毒、抗炎、抗氧化等藥理活性[24]，研究表明其可能是通過抑制SGC-7901、ECV304 細胞不同能量代謝酶活力，減少ATP 生成，改善細胞酸性微環境，抑制胃癌細胞增殖和腫瘤血管生成發揮抑癌作用[25]。除此之外，研究證實黃芩素、川陳皮素和柚皮素對人胃癌細胞具有較強的增殖抑制作用[26-28]。

3.2 主要靶標與通路分析

在GO 功能分析中發現組方對金屬離子的反應、氧化應激的反應、脂多糖應答過程的積極調節作用；通過靶點PPI 網絡分析及關鍵靶點的篩選，發現度值較高的靶點為MAPK1/3、AKT1、Bcl、IL、BAD、IKBKB、NFKBIA、JUN、CASP9 等，從不同方面與炎癥反應存在一定關系，且與其他中藥復方治療慢性胃炎報道關鍵靶點吻合。研究表明，AKT/MAPK 途徑是保護胃黏膜的重要潛在機制，對消化道炎-癌轉化進展至關重要[29,30]。目前證據證實，MAPK1/3 等可以通過促炎反應導致細胞變異[31]，AKT1 是PI3K 的靶向基因，活性成分可通過AKT1 途徑增強胃癌細胞體外增殖及侵襲力，進一步證實AKT1 在胃癌的發生發展過程中的潛在作用[32]。可以預測：組方活性成分 QT、Lut、Kae、Wogonin 等可能作用于 MAPK、AKT、Bcl 而發揮藥理作用。

在KEGG 道路分析中發現MAPK 信號通路、PI3K/AKT 信號通路等多條信號轉錄通路通過實驗研究與炎-癌轉化關系密切。其中，MAPK通路上游的許多因子，如RASAL1、白介素-22（IL-22）、CCDC134、NAIF1、ZIC1等，可能通過ERK/MAPK 通路影響胃癌細胞系的增殖、侵襲和遷移[33]。此外，PI3K/AKT 信號通路不僅調節腫瘤細胞的增殖與活化，還影響腫瘤細胞的侵襲、遷移、細胞外基質的降解以及腫瘤血管生成等[34]。

3.3 展望

綜上所述，本研究面向隱結構模型和網絡藥理學探討“調肝守恒”治療慢性胃炎的潛在生物學機制，候選成分中QT、Lut、Kae 可能是組方發揮作用的關鍵成分，交集基因富集于MAPK 信號通路、PI3K/AKT 信號通路等經典炎癥-腫瘤信號通路發揮作用。鑒于方法學局限性，對疾病發生、發展、傳變仍有諸多不明，后期對治法、組方活性成分、作用靶點、作用通路、治療效果進行實驗室與臨床驗證以及知識產權轉化，是課題組下一步工作重點。