超高效液相色譜-串聯質譜法檢測綠茶中16種農藥殘留

李自強，楊梅，張新忠，羅逢健，周利，樓正云，孫荷芝，王新茹，陳宗懋

超高效液相色譜-串聯質譜法檢測綠茶中16種農藥殘留

李自強1,2，楊梅1*，張新忠1*，羅逢健1，周利1，樓正云1，孫荷芝1，王新茹1，陳宗懋1

1. 中國農業科學院茶葉研究所農產品質量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2. 吉林農業大學植物保護學院，吉林 長春 130000

建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）同時檢測綠茶中16種農藥殘留的分析方法。采用1%甲酸乙腈提取綠茶樣品中的目標農藥，經TPT-SPE柱凈化，在電噴霧正離子源（ESI+）模式下電離，質譜多反應監測模式（MRM）對目標母離子和子離子進行掃描測定。通過對樣品提取、凈化以及色譜條件優化，目標農藥濃度范圍在0.005～1.000?mg·kg-1線性良好，相關系數R＞0.992?6；在0.010、0.050、0.100?mg·kg-1和1.000?mg·kg-14個添加水平下，平均回收率在74.0%～105.4%，相對標準偏差（RSD）＜20.0%；方法的定量限為10～50?μg·kg-1。該方法分析速度快，靈敏度高，各項技術指標均符合國內外相關法規標準，可滿足綠茶中多種農藥殘留同時檢測的要求。

農藥多殘留分析；超高效液相色譜-串聯質譜；TPT-SPE柱凈化；綠茶

茶樹是我國主要經濟作物之一，其生長環境一般為濕熱環境，容易受到病蟲草的侵害[1-3]。與其他飲品相比，茶具有抗炎、抗癌活性以及降低高血壓、糖尿病和心腦血管疾病發生等功效，目前飲茶已經在全球范圍內流行[4-5]。為了保證茶葉的產量和品質，施用農藥依舊是目前茶園病蟲害防治的主要措施，這可能造成茶葉農藥殘留問題[6]，因此農藥殘留帶來的產品質量問題越來越受到人們關注。

目前，許多國家和國際組織均規定了茶葉中農藥的最高殘留限量（MRL）標準[7-8]。我國是茶葉出口大國，農藥殘留問題往往是我國茶葉出口的一道壁壘。歐盟作為我國茶葉出口的主要市場之一，部分農藥的殘留限量標準比我國更為嚴格，如氟蟲脲、甲萘威、醚菊酯、噻蟲胺等農藥MRLs值均低于我國[9-10]。2016—2020年我國茶葉由于農藥殘留超標已被歐盟委員會食品與飼料快速預警系統（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）通報多次，其中呋蟲胺、啶氧菌酯、唑蟲酰胺等農藥均出現了超標情況[11]。我國在GB/T 2763—2021中新增了啶氧菌酯、殺撲磷及甲基異柳磷等農藥在茶葉中的MRL值，并將茶葉中克百威的MRL值由0.05?mg·kg-1降至0.02?mg·kg-1。基于此，為保證我國茶葉出口，對上述農藥的精確檢測十分必要。

由于農藥種類眾多，其自身結構及化學性質均有不同，需要用不同類型的儀器設備進行檢測[12]。目前，茶葉中農藥殘留檢測的分析儀器包括液相色譜（LC）[13]、氣相色譜（GC）[14]、高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）[15]、超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）[16]、氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）[17]等。與其他幾種檢測技術相比，UPLC-MS/MS因其具有靈敏度高、可有效降低基質及其他因素的干擾等特點，目前已經成為茶葉中多種類型農藥殘留分析的首選方法[18]。此外，由于茶葉基質的復雜性，樣品前處理是影響測量結果能否精確的關鍵性步驟。目前，茶葉的前處理方法主要有分散固相萃取（DSPE）[19]、QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法[20]、分散液-液微萃取法（DLLME）[21]及固相萃取（SPE）[22]等。SPE因其具有操作簡便，易與檢測儀器聯用，適配性好和回收率好等優點[23]，成為實驗室中最常用的樣品前處理方法之一。因此，本研究采用SPE進行樣品前處理，采用UPLC-MS/MS方法檢測目標化合物的殘留。

本研究選用茶葉中常見、易檢出的16種農藥，建立TPT-SPE凈化與UPLC-MS/MS相結合的方法，用于同時檢測其在綠茶中殘留，為茶葉中農藥殘留的快速檢測提供可靠且有效的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜串聯Xevo TQ-S micro三重四極桿串聯質譜儀，配有MassLynx 4.1處理軟件（美國Waters公司）；3K-15冷凍離心機（德國Sigma公司）；Vortex Genie 2型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries）；R-210旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；0.22?μm Filter Unit濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

農藥標準物質：呋蟲胺、氟啶蟲酰胺、噻蟲胺、噻蟲啉、克百威、甲萘威、殺撲磷、啶氧菌酯、甲基異柳磷、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、唑蟲酰胺、吡丙醚、氟蟲脲、乙螨唑、醚菊酯（德國CNW Technologies Gmb H公司，純度＞99.0%）。甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；苯（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；超純水（杭州娃哈哈有限公司）；Cleanert PestiCarb-SPE柱（填料量/上樣體積：500?mg/6 mL）、Cleanert PSA-SPE柱（填料量/上樣體積：1?g/6?mL）、Cleanert TPT-SPE柱（填料量/上樣體積：1?g/6?mL）和Cleanert Florisil-SPE柱（填料量/上樣體積：500?mg/3?mL）購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 標準溶液配制

混合標準品母液（10?mg·L-1）的配制：精準稱取不同質量的農藥標準物質于50?mL容量瓶中，并用乙腈進行溶解，定容，配制成濃度為100～500?mg·L-1的16種農藥單標準品儲備液。之后分別吸取不同體積的16種農藥單標準品儲備液于50?mL容量瓶中，用乙腈稀釋混勻后定容至刻度線，放置在4℃冰箱中保存。

混合標準品工作液的配制：臨用前，用乙腈對上述混合標準品母液（10?mg·L-1）進行稀釋，配制成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005?mg·L-1系列濃度的溶劑標準溶液。

茶葉基質匹配標準溶液的配制：綠茶空白樣品經前處理后，在定容時加入系列混合標準品工作液，配制成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005?mg·L-1系列濃度的基質匹配標準混合溶液。

1.3 樣品的提取與凈化

1.3.1 提取

準確稱取5.00?g粉碎后的綠茶空白樣品（精確至0.01?g）于50?mL帶蓋離心管中，加入10?mL水后混勻靜置30?min，再加入20?mL 1%甲酸乙腈，渦旋振蕩1?min，靜置過夜后加入5.00?g氯化鈉，渦旋振蕩1?min，10?000?r·min-1離心5?min，然后取8?mL上清液于雞心瓶中，旋轉蒸發至接近干燥，再加入5?mL乙腈-苯

（乙腈∶苯=3∶1，下同）超聲溶解，待凈化。

1.3.2 凈化

將TPT-SPE柱置于固相萃取裝置上，用10?mL乙腈-苯預淋洗，棄去淋洗液。將雞心瓶中溶液轉移至TPT-SPE柱，接收流出液，繼續加入25?mL乙腈-苯洗脫，合并接收流出液，旋轉蒸發濃縮至近干后吹干，加入2?mL乙腈溶解殘渣，過0.22?μm尼龍微孔濾膜后轉移至進樣小瓶，待UPLC-MS/MS進樣分析。

1.4 添加回收率試驗

在綠茶空白樣品中，分別添加不同濃度的標準混合溶液，制備添加濃度水平為0.010、0.050、0.100?mg·kg-1和1.000?mg·kg-1的綠茶添加樣品，每個添加水平3個重復，渦旋混勻后過夜放置，按照1.3章節進行提取凈化后測定，以添加樣品與基質標準樣品中化合物的峰面積之比計算添加回收率，并獲得相對標準偏差（RSD）。

1.5 檢測條件

色譜條件：流動相A為0.1%甲酸-甲醇，流動相B為純凈水。流動相洗脫程序：0～1.5?min，5%～65% A；1.5～5.0?min，65%～85% A；5.0～7.5?min，85%～99% A；7.5～9.0?min，99%～100% A；9.0～9.8?min，100% A；9.8～10.3?min，100%～10% A。色譜柱：Acquity HSS T3（100?mm×2.1?mm，1.8?μm）；柱溫：40℃。進樣量體積：5.0?μL；流速：0.25?mL·min-1。

質譜條件：電噴霧正電離模式ESI+，多反應監測MRM模式；離子源溫度：150℃；脫溶劑N2氣溫度：350℃；流量：700?L·h-1；毛細管電壓：3.5?kV；碰撞氣Ar流量：0.35?mL·min-1；錐孔氣N2流量：60?L·h-1；倍增電壓：650?V。

1.6 數據統計與分析

回收率、標準曲線方程、基質效應等數據通過Excel 2019進行計算，使用OriginPro 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件優化

將16種目標化合物分別用乙腈配制成濃度為1.000?mg·L-1的溶液，用ESI+和ESI–模式進行全掃描，得出在ESI+模式下16種目標化合物響應較高。因此，16種目標化合物皆以[M+H]+為母離子進行二級質譜優化。優化最佳的錐孔電壓，然后進行子離子掃描，每種化合物選擇2個響應值最強的子離子作為定量離子和定性離子。最后在多反應監測（MRM）模式下，優化目標物離子碎片的最佳碰撞能量。最終在最佳條件下對16種目標農藥進行檢測，選擇的質譜參數如表1所示。

2.1.2 色譜條件優化

在優化的質譜條件下，考察了不同流動相對目標農藥質譜信號的影響。通常，在流動相中加入一定量的甲酸可以有效地增加目標化合物的離子化效率和優化峰形。因此，本研究通過執行1.5章節的梯度洗脫程序分別考察0.1%甲酸乙腈-水和0.1%甲酸甲醇-水作為流動相對16種目標化合物的分離效果。結果發現，0.1%甲酸乙腈-水作為流動相時目標化合物被更早的分離出來，當0.1%甲酸甲醇-水作為流動相時，雖然目標化合物的出峰時間有一定程度后移，但16種目標化合物離子響應、峰形及分離度更好。因此，最終確定采用0.1%甲酸甲醇-水作為本研究的流動相。

表1 16種農藥的UPLC-MS/MS多反應監測參數

注：*指定量離子

Note: * represents quantification ions

2.2 樣品前處理方法的優化

2.2.1 提取溶劑的優化

GB/T 23200.13—2016[24]中采用乙腈來提取茶葉中的農藥殘留。但是，本研究涉及的目標農藥如克百威、甲萘威等顯酸性，在提取溶劑中加入適量的酸，可一定程度增加目標農藥在溶劑中的溶解度，從而提高提取效果[25-27]。此外，已有研究發現，對于氟啶蟲酰胺、噻蟲嗪和甲萘威等農藥，甲酸-乙腈提取效果優于乙酸-乙腈[28-29]。因此，本研究對比了乙腈中含有不同比例（0%、1%、2%、5%）甲酸對農藥的提取效果。結果如圖1所示，采用含有1%甲酸的乙腈溶劑對添加水平為0.100?mg·kg-1綠茶空白樣品進行提取，16種農藥的回收率達到76.4%～106.5%，RSD為0.3%～17.2%；采用2%甲酸-乙腈進行提取，對呋蟲胺和殺撲磷兩種農藥的提取效果比較差；同樣，采用5%甲酸-乙腈進行提取，其對16種農藥的綜合提取效果略低于用1%甲酸-乙腈提取。而采用乙腈進行提取效果最差，大多數農藥的回收率均未達到標準。因此選擇含有1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化方式的優化

本研究比較了實驗室常用的4種填料（PSA、GCB、Florisil、TPT）SPE柱對目標化合物回收率的情況。將0.50?mg·L-1的混合標準溶液，直接上樣至不同的SPE柱進行凈化，在相同的洗脫條件下，比較不同凈化柱對目標化合物的洗脫效果。結果如圖2所示，4種SPE柱中，TPT柱對這16種農藥的凈化效果最好，對目標農藥的回收率達到了72.2%～103.7%，RSD為0.6%～5.5%。而PSA柱、GCB柱、Florisil柱均存在對一種或幾種目標化合物洗脫困難的情況（如甲氨基阿維菌素B1a，甲氨基阿維菌素B1b）。這主要是因為Florisil柱和GCB柱對其吸附能力較強，難以洗脫，從而造成回收率較低[30]。因此，本研究選擇TPT-SPE柱作為凈化材料。

注：A：呋蟲胺；B：氟啶蟲酰胺；C：噻蟲胺；D：噻蟲啉；E：克百威；F：甲萘威；G：殺撲磷；H：啶氧菌酯；I：甲基異柳磷；J：甲氨基阿維菌素B1a；K：甲氨基阿維菌素B1b；L：唑蟲酰胺；M：吡丙醚；N：氟蟲脲；O：乙螨唑；P：醚菊酯。下同

圖2 不同凈化柱對農藥回收率的影響

2.3 方法評價

2.3.1 方法的線性范圍和基質效應

本研究的線性結果如表2所示，在0.005～1.000?mg·kg-1的濃度范圍內，16種農藥基質標準曲線線性關系良好，相關系數R在0.992?6～0.999?9，達到殘留定量分析的要求。基質效應（Matrix effect，%）是指樣品中的其他成分對分析測定產生的影響，主要是對分析物的濃度與測定準確度的影響，從而引起定量和定性的誤差[31]。而由于茶葉基質的復雜性，則更有必要對茶葉中的基質效應進行評價。基質效應計算公式[32]如下：

Matrix effect=/×100%

其中為溶劑標準曲線的斜率，為基質標準曲線的斜率。通過計算得出16種農藥在綠茶基質中的基質效應。結果如表2所示，目標農藥分別在溶劑和茶葉基質中的線性關系良好。但是由于茶葉中含有色素、咖啡堿、糖類等多種復雜基質，在檢測過程中會產生比較明顯的基質效應。本研究中16種農藥在檢測過程中出現了較強的基質抑制效應。所以，為滿足不同種類茶葉的檢測要求，減輕或者消除基質效應產生的干擾，本研究采用基質匹配曲線校準進行定量分析[33-34]。

2.3.2 方法的準確度、精密度和定量限

綠茶基質中16種農藥的添加回收率和精密度見表3。在0.010、0.050、0.100?mg·kg-1和1.000?mg·kg-14個添加水平下，目標化合物的回收率范圍在74.0%～105.4%，RSD＜20.0%，該方法的回收率和精密度良好，符合農藥殘留檢測對回收率和重現性的要求。本研究將回收率在70%～120%之間的最低添加濃度定義為方法的定量限（LOQ）。結果見表3，16種農藥的定量限為10～50?μg·kg-1。

2.4 實際樣品測定結果

本研究通過已建立的方法對實驗室隨機抽取的20份綠茶樣品進行檢測（樣品于2021年5月—12月收集），其中有9份樣品檢出噻蟲胺（0.010～0.049?mg·kg-1），6份樣品檢出氟蟲脲（0.090～0.310?mg·kg-1），2份樣品檢出唑蟲酰胺（0.065～0.078?mg·kg-1），1份樣品檢出吡丙醚（0.038?mg·kg-1），其余12種農藥均未檢出。其中檢出農藥的殘留量均低于歐盟[9]和我國GB/T 2763—2021[10]中規定的最大殘留限量。

表2 不同農藥的線性方程和相關系數

表3 16種農藥的添加回收率、相對標準偏差、檢出限和定量限（n=3）

續表3

3 結論與討論

本研究通過對樣品提取凈化、儀器條件進行優化，比較不同條件下對目標化合物回收率的影響，建立了1%甲酸乙腈進行提取，TPT-SPE柱凈化與UPLC-MS/MS相結合的方法，成功用于同時檢測綠茶中16種農藥的殘留。該方法重復性好，靈敏度高，目標農藥在0.005～1.000?mg·kg-1范圍內線性良好，相關系數R＞0.992?6。在0.010、0.050、0.100?mg·kg-1和1.000?mg·kg-1的添加水平下，農藥的平均回收率在74.0%～105.4%，RSD＜20.0%，方法的定量限為10～50?μg·kg-1。此外，將建立的方法與國內外文獻中報道的方法進行了比較，結果如表4所示。與其他方法相比，本方法涉及的農藥更為廣泛，除了茶葉中常用的幾種農藥外，還將GB/T 2763—2021在茶葉中新增加的農藥如啶氧菌酯、殺撲磷以及甲基異柳磷加入到檢測行列中，具有一定的先進性，大大增加了茶葉中農藥殘留檢測的實用性。此外，GB/T 2763—2021中規定本研究的目標農藥在茶葉中的檢測總共需要4種不同的方法，與其相比，本研究的方法更簡便，用一種方法便可同時檢測16種目標化合物，并且定量限遠遠低于其規定的目標化合物在茶葉中的最大殘留限量。本方法的靈敏度與其他文獻中報道的單一農藥檢測或多農藥檢測方法相比，其定量限較低，顯示出較高的靈敏度，滿足了日常農藥殘留痕量檢測的需求。

表4 本方法與其他已報道方法的對比

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Residue Determination of Sixteen Pesticides in Green Tea by UPLC-MS/MS

LI Ziqiang1,2, YANG Mei1*, ZHANG Xinzhong1*, LUO Fengjian1, ZHOU Li1, LOU Zhengyun1, SUN Hezhi1, WANG Xinru1, CHEN Zongmao1

1. Research Center of Quality Safety for Agricultural Products, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences Hangzhou 310008, China; 2. College of Plant Protection, Jilin Agricultural University, Changchun 130000, China

An analytical method was developed for the simultaneous determination of 16 pesticide residues in green tea by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The target pesticides in tea samples were extracted by acetonitrile with 1% formic acid, cleaned up by a TPT-SPE column, ionized in electrospray positive ionization source (ESI+) mode, and scanned for determination of the target parent and daughter ions by mass spectrometry in multiple reaction monitoring mode (MRM). The results show that the target pesticides were linear in the range of 0.005-1.000?mg·kg-1with the correlation coefficient2＞0.992?6. The average recoveries ranged from 74.0% to 105.4% at the four spiked levels of 0.010, 0.050, 0.100、1.000?mg·kg-1, and the relative standard deviations (RSD) were <20.0%. The limits of quantification were 10-50?μg·kg-1. The method is fast and sensitive, and the technical parameters are in accordance with the relevant domestic and international regulations and standards. And it can meet the requirements of simultaneous determination of various pesticide residues in green tea.

multi-residue of pesticides analysis, UPLC-MS/MS, TPT-SPE column clean, green tea

S571.1

A

1000-369X(2022)04-537-12

2021-11-02

2022-02-17

浙江省自然科學基金（LQ19B070007）、國家自然科學基金（42007354）

李自強，男，碩士研究生，主要從事農藥快速檢測研究。*通信作者：ymei2016@126.com，zxz.1982@163.com