頭穴艾灸聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和氧化應(yīng)激的效果

關(guān)瑩，于國(guó)強(qiáng)，唐祎周，辛貴樂，李季，王璐，張立，張春艷

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市 150001

0 引言

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是由多種腦組織缺血缺氧而致的繼發(fā)性認(rèn)知障礙綜合征，給患者的日?；顒?dòng)和社會(huì)生活造成巨大障礙[1]。隨著我國(guó)人口老齡化加劇，腦血管疾病以及VaD 的患病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。在眾多癡呆類型中，VaD 被認(rèn)為是可防治的唯一類型[3]。長(zhǎng)期口服西藥治療VaD 效果不確定且副作用明顯[4]，而中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)明顯，針灸治療臨床效果顯著且不良反應(yīng)小[5]。本課題組聯(lián)合應(yīng)用頭穴艾灸與康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中后認(rèn)知障礙，發(fā)現(xiàn)患者的記憶力、計(jì)算力、執(zhí)行能力等認(rèn)知功能均有顯著恢復(fù)[6-7]。

慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是VaD 的重要發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激損傷是VaD發(fā)病的病理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激嚴(yán)重?fù)p傷海馬、皮質(zhì)等關(guān)鍵腦區(qū)的神經(jīng)元，從而引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙[8]。本研究以丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物還原酶(glutathione peroxidase reductase,GSH-Px)為主要觀察指標(biāo)，探討灸康結(jié)合對(duì)VaD 大鼠海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)6 周齡健康雄性Sprague-Dawley 大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SYXK(黑)2010007。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食水，鼠籠及墊料定期清洗更換。

1.2 試劑與儀器

SOD 檢測(cè)試劑盒(WLA110b)、MDA 檢測(cè)試劑盒(WLA048b)、GSH 檢測(cè)試劑盒(WLA074b)、GSH-Px檢測(cè)試劑盒(WLA026b)：沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。Morris 水迷宮：上海欣軟信息科技。ZH-PT 型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。Hettich Mikro 220 冷凍離心機(jī)：德國(guó)HETTICH 公司。Multiskan FC 型酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMO 公司。-80 ℃超低溫冰箱：日本PANASONIC 公司。DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。DK-8D型三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司。

1.3 造模與分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，任意挑選30 只采用雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法(2 vessels occlusion,2VO)[9]復(fù)制CCH 致VaD 大鼠模型。術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉；待翻正反射消失后，仰臥位固定，頸部備皮消毒，頸正中切口，長(zhǎng)2 cm 左右；鈍性分離皮下組織和肌肉組織，充分暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，絲線分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端和近心端，從中間剪斷。觀察大鼠呼吸、心跳平穩(wěn)即縫合皮膚，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

假手術(shù)組8 只，手術(shù)步驟同上，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后僅套絲線，不阻斷血流。

大鼠術(shù)后均予青霉素4 萬(wàn)U 肌肉注射，每天1 次，連續(xù)4 d。密切觀察大鼠傷口愈合情況。

造模6 周后，所有造模大鼠采用Morris 水迷宮評(píng)估認(rèn)知功能，篩選出成績(jī)相似的24只分為模型組、針康組和灸康組，每組8只。

1.4 方法

針康組根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]并參照大鼠骨骼與體型，取百會(huì)、神庭穴，采用直徑0.25 mm、長(zhǎng)25 mm針灸針，針身與大鼠頭皮成15°由前向后平刺，深20 mm，得氣后快速捻轉(zhuǎn)1 min，將大鼠置于電動(dòng)跑臺(tái)內(nèi)，電擊驅(qū)動(dòng)大鼠奔跑[11]，持續(xù)20 min。跑臺(tái)訓(xùn)練后出針。跑臺(tái)速度：1～3 d 5 m/min，4～14 d 10 m/min，14 d后15 m/min。每天1次，共4周。

灸康組點(diǎn)燃自制細(xì)艾條(直徑0.5 cm、長(zhǎng)10 cm)于大鼠百會(huì)、神庭穴處施灸，每次20 min。灸后行跑臺(tái)訓(xùn)練，方法同針康組。

假手術(shù)組和模型組籠中常規(guī)喂養(yǎng)。

1.5 Morris水迷宮[12]

Morris 水迷宮為一池壁粗糙的圓形不銹鋼水池，直徑160 cm，高60 cm，池水深25 cm，水溫(21±1) ℃。第三象限中央放置直徑10 cm 的無(wú)色透明平臺(tái)，水池注水后水面高于平臺(tái)2 cm。前4 d 行定位航行試驗(yàn)，每天固定時(shí)間段測(cè)試2 次：大鼠每天從第三象限以外的任意象限池邊圓弧中點(diǎn)入水，從大鼠入水至四肢完全站上平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期；如90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，引導(dǎo)大鼠站上平臺(tái)，逃避潛伏期記為90 s。第5 天行空間探索試驗(yàn)：撤除平臺(tái)，從第三象限以外的任一象限將大鼠放入水中，記錄90 s 內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)及在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

1.6 氧化應(yīng)激

水迷宮檢測(cè)后，大鼠10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，斷頭取腦，冰盒上迅速分離海馬組織，稱重后加入預(yù)冷的生理鹽水，制成10%海馬勻漿液，4 ℃3000 r/min 離心15 min，取上清液。按試劑盒說明測(cè)量MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以()表示，重復(fù)獲取結(jié)果比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短(P＜0.001)。定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠逃避潛伏期呈逐日縮短趨勢(shì)；訓(xùn)練第3、第4 天，針康組和灸康組逃避潛伏期較模型組顯著縮短(P＜0.001)，灸康組短于針康組?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，針康組、灸康組與模型組組間比較，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.001)且灸康組優(yōu)于針康組。見表1、表2。

表1 各組逃避潛伏期比較 單位：s

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 氧化應(yīng)激

與假手術(shù)組比較，模型組MDA 水平顯著增加，SOD、GSH 和GSH-Px 水平顯著下降(P＜0.001)；與模型組比較，灸康組和針康組MDA 水平顯著下降，SOD、GSH 和GSH-Px 水平顯著增加(P＜0.001)，且灸康組顯著優(yōu)于針康組(P＜0.001)。見表3。

表3 各組氧化應(yīng)激水平比較

3 討論

VaD 屬中醫(yī)“呆病”的范疇，其病位在腦，多因腦竅蒙蔽而發(fā)病。百會(huì)為督脈要穴，位于巔頂，為手足三陽(yáng)、督脈、足厥陰交會(huì)之處；百會(huì)配合神庭具有安神定志，調(diào)節(jié)情緒之功[13]。

CCH后，神經(jīng)元代謝降低，引起神經(jīng)元變性，逐漸出現(xiàn)以認(rèn)知功能受損為主要表現(xiàn)的腦功能減退[14-16]。CCH還可使微血管神經(jīng)偶聯(lián)，大血管血流能量供給需求持續(xù)增加，最終導(dǎo)致腦功能障礙，出現(xiàn)認(rèn)知障礙[17]。VaD 的另一病理基礎(chǔ)為氧化應(yīng)激損傷：CCH 使抗氧化能力受損，自由基難以清除，與細(xì)胞膜磷脂、核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)[18]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，神經(jīng)元破壞，發(fā)生VaD[19]。

MDA 是氧自由基攻擊生物膜時(shí)形成的脂質(zhì)過氧化代謝終末產(chǎn)物，可反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷情況[20]。SOD 對(duì)超氧陰離子自由基有清除作用，通過阻止脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[21]。GSH水平與氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，監(jiān)測(cè)GSH水平有助于疾病早期診斷和評(píng)估治療效果[22]。GSH-Px直接或間接充當(dāng)抗氧化劑，代表了機(jī)體抗氧化能力[23]。

本研究顯示，與針康法相比，艾灸與康復(fù)結(jié)合能更好改善VaD 大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能，更好降低氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

針刺和艾灸均以經(jīng)絡(luò)腧穴為理論基礎(chǔ)。針刺以金屬針具刺入人體特定穴位，對(duì)人體局部產(chǎn)生機(jī)械刺激作用，具有調(diào)和陰陽(yáng)、扶正祛邪、行氣活血、疏通經(jīng)絡(luò)等功效[24]；艾灸通過燃燒艾絨對(duì)特定穴區(qū)產(chǎn)生溫?zé)岽碳?，發(fā)揮溫通經(jīng)絡(luò)、行氣活血、祛濕逐寒、消腫散結(jié)、回陽(yáng)救逆等作用[25-27]。本課題組前期研究證實(shí)，頭穴針刺可調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的功能，改善病理狀態(tài)的腦功能[28-30]。但由于認(rèn)知障礙患者對(duì)針刺存在恐懼心理，且部分患者難以接受針刺造成的疼痛、出血等副作用，依從性較差，難以堅(jiān)持長(zhǎng)期治療。中醫(yī)傳統(tǒng)理論有“針?biāo)粸椋闹恕薄爸T療之要，火艾為良”的記載[31]。艾灸的作用可分為物理和化學(xué)兩個(gè)方面：物理作用即熱輻射，包括遠(yuǎn)紅外輻射和近紅外輻射，使體內(nèi)ATP 水解，為細(xì)胞活動(dòng)提供能量[32]，熱傳遞還能改變蛋白質(zhì)、細(xì)胞和組織的性質(zhì)[33]；化學(xué)作用是指艾灸生成物的藥理作用，如抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗自由基和抗衰老等[34]。趙利華等[35]的研究顯示，艾灸特定穴能降低氧化代謝，提高輕度認(rèn)知障礙患者認(rèn)知水平。李丹等[36]發(fā)現(xiàn)，艾煙PM10 能拮抗神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激下的凋亡。

運(yùn)動(dòng)療法是現(xiàn)代康復(fù)醫(yī)學(xué)中重要的物理治療方法，在改善運(yùn)動(dòng)功能的同時(shí)，也能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，長(zhǎng)期適量運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)海馬祌經(jīng)元突觸可塑性，提高學(xué)習(xí)記憶能力[37-38]。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，尤其是中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有抗氧化作用，可抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠腦血管神經(jīng)再生和重要神經(jīng)遞質(zhì)合成，改善血液循環(huán)和神經(jīng)連接，減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生有益影響[39-41]。規(guī)律跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以激活1 型糖尿病大鼠海馬CA1、CA3區(qū)信號(hào)通路，增強(qiáng)海馬抗氧化能力，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力[42]。跑臺(tái)訓(xùn)練能上調(diào)腦梗死周邊皮質(zhì)Ngb 表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，從而恢復(fù)腦梗死大鼠神經(jīng)功能[43]。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明艾灸與運(yùn)動(dòng)療法的結(jié)合可降低氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而改善VaD模型大鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。