膠質瘤組織TMEM168的表達與病人預后的關系

馬 鵬 王建村 黃 杰 薛 強

膠質瘤是最常見的顱內原發性惡性腫瘤，其發病機制尚不清楚，即使采用手術聯合術后放化療等綜合治療，預后較差。跨膜蛋白（transmembrane protein，TMEM）家族參與多種病理生理過程，包括細胞信號轉導、細胞趨化、粘附、凋亡和自噬。Xu等[發現，TMEM168在膠質母細胞瘤細胞中高表達，通過Wnt/β-Catenin 信號通路促進細胞增殖和侵襲。本文探討膠質瘤組織TMEM168 表達水平及其與病人預后的關系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標準 納入標準：年齡≥18歲；臨床資料完整；術后病理證實為腦膠質瘤；術前未接受放、化療。排除標準：合并其他部位腫瘤；合并急慢性感染；合并嚴重心肝腎等臟器疾病；合并內分泌疾病。

1.2 標本來源 選取2014 年6 月至2016 年9 月手術切除的符合標準的腦膠質瘤140例，其中男88例，女52例；年齡23～78歲，平均（53.01±8.23）歲；高級別膠質瘤76例（WHO分級Ⅲ級26例，Ⅳ級50例），低級別膠質瘤64 例（WHO 分級Ⅰ級12 例，Ⅱ級52 例）。選取顱腦損傷內減壓術中切取的非腫瘤腦組織50 例為對照，其中男29 例，女21 例；年齡29～65 歲，平均（54.13±5.54）歲。

1.3 免疫組化染色檢測TMEM168 的表達 組織標本石蠟包埋，制備切片（4 μm）。根據免疫組化染色試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司）說明書進行操作。切片脫蠟、水化后，進行抗原修復。用封閉液封閉2 h，加入兔抗人TMEM168一抗（1:1 000，美國Sigma公司）溫室孵育2 h，PBS洗滌2次，加入二抗室溫孵育30 min。用DAB顯色、蘇木精復染，最后封片顯微鏡下觀察，TMEM168 蛋白定位于細胞質內（圖1）。每張切片隨機選擇5個高倍（×200）視野進行評分：染色評分由染色強度評分（無著色0分，淺棕色1分，中棕色2分，深棕色3分）和染色細胞百分比評分（無染色為0 分；＜25%為1 分；25%～75%為2 分；＞75%為3分）相乘得出，其中4～9分為高表達。

圖1 免疫組化染色檢測組織TMEM168表達（EnVision二步法，×200）

1.4 隨訪方法 術后進行電話和門診隨訪。術后第一年每3 個月隨訪一次，隨后每半年隨訪1 次，隨訪時進行MRI檢查。隨訪截止2021年10月，記錄總生存期（overall survival，OS）及無進展生存期（progressfree survival，PFS）。OS 指術后首日至末次隨訪或者死亡的時間；PFS 指術后首日至首次發生疾病進展或任何原因所致死亡的時間。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計數資料采用

χ

檢驗；采用多因素Cox比例回歸風險模型分析生存預后的影響因素；生存曲線分析TMEM168表達水平與病人生存預后的關系；

P

＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤組織TMEM168 的表達情況 膠質瘤組織TMEM168 高表達率[70.71%（99/140）]明顯高于對照組[22.00%（11/50）；

P

＜0.05]。高級別膠質瘤組織TMEM168 高表達率[81.58%（62/76）]明顯高于低級別膠質瘤組織[57.81%（37/64）；

P

＜0.05]。

2.2 膠質瘤的預后 術后隨訪3～60個月，死亡46例，復發87例。

2.3 膠質瘤生存預后的影響因素 多因素Cox回歸分析顯示，年齡≥55歲、高級別膠質瘤、術前KPS評分＜80 分、TMEM168 高表達是膠質瘤病人OS 和PFS 不良的獨立危險因素（

P

＜0.05；表1、2）。

表1 本文140例膠質瘤病人總生存期影響因素的Cox比例回歸風險模型分析

危險因素年齡≥55歲男性術前KPS評分＜80分高級別膠質瘤腫瘤直徑＞3 cm腫瘤未全切除術后未化療TMEM168高表達單因素風險比1.300 1.417 2.981 4.116 1.231 1.047 1.013 3.442 95%置信區間1.098～3.276 0.901～1.514 1.673～3.990 2.003～7.651 0.547～1.672 0.774～1.130 0.783～1.316 1.605～7.742 P值0.008 0.552＜0.001＜0.001 0.513 0.624 0.101＜0.001多因素風險比1.261 95%置信區間1.115～4.008 P值0.013 2.683 3.170 1.515～3.654 2.000～6.333＜0.001＜0.001 2.251 1.412～4.971＜0.001

表2 本文140例膠質瘤無進展生存期影響因素的Cox比例回歸風險模型分析

危險因素年齡≥55歲男性術前KPS評分＜80分高級別膠質瘤腫瘤直徑＞3 cm腫瘤未全切除TMEM168高表達單因素風險比2.615 1.004 3.054 5.233 1.132 1.212 4.100 95%置信區間1.422-3.098 0.564-1.123 1.232-5.101 2.611-9.231 0.603-1.231 0.803-1.452 2.314-8.142 P值0.011 0.574 0.000 0.000 0.459 0.338 0.000多因素風險比1.800 95%置信區間1.096-2.938 P值0.035 2.131 3.163 1.462-4.000 1.202-7.451 0.000 0.000 3.100 1.323-5.282 0.000

2.4 膠質瘤TMEM168 表達水平與病人預后的關系生存曲線分析結果顯示，TMEM168高表達膠質瘤病人中位OS、PFS 較低表達病人明顯縮短（

P

＜0.05，圖2）。

圖2 生存曲線分析膠質瘤TMEM168表達水平與病人生存預后的關系

3 討論

TMEM 家族參與細胞膜結構組成，參與細胞間和細胞內的信號轉導，與免疫炎癥損傷和線粒體功能障礙有關。TMEM家族與腫瘤的關系近年來引起重視，研究發現，TMEM 可通過影響細胞增殖、侵襲、凋亡，影響腫瘤的發生、發展，例如TMEM116通過PDK1 信號通路促進肺癌細胞的侵襲和轉移，與肺癌不良生存預后有關。TMEM168 蛋白是由697 個氨基酸殘基組成，在人類和嚙齒類動物中均有表達。TMEM168高表達參與感覺門控缺陷、精神分裂癥和成癮性疾病等。TMEM168 基因突變也與家族性Brugada 綜合征有關。有研究發現，TMEM168 在膠質母細胞瘤細胞中高表達，可通過Wnt/β-Catenin信號通路促進細胞增殖和侵襲。本文發現，TMEM168在膠質瘤組織中的高表達率明顯高于非腫瘤腦組織，并且高級別膠質瘤組織明顯高于低級別膠質瘤組織。這提示TMEM168 可能參與膠質瘤的發生、發展。然而，TMEM168 在膠質瘤中的具體作用機制，尚不明確，有待進一步研究。

膠質瘤病人預后的影響因素較多。本文發現年齡、高級別膠質瘤、術前KPS 評分是OS 及PFS 的獨立影響因素。這與文獻報道一致。Xu 等發現TMEM168 高表達的膠質母細胞瘤總體生存率明顯降低。本文也發現，TMEM168高表達是膠質瘤病人OS 和PFS 不良的獨立危險因素（

P

＜0.05）；生存曲線分析顯示TMEM168高表達膠質瘤病人的中位OS及PFS較低表達病人明顯縮短（

P

＜0.05）。

本文也存在一些局限性，例如未分析TMEM168在膠質瘤中的作用機制；未分析TMEM168與膠質瘤手術療效及放化療效果的關系。另外，未來需要開展細胞和動物學研究，分析TMEM168在膠質瘤病情進展中的作用及機制。

總之，膠質瘤組織TMEM168 呈高表達，與膠質瘤病人不良生存預后有關。