脊柱結核患者骨密度與骨髓間充質干細胞遷徙研究

郭超峰，胡小江，李 韜，張宏其，高琪樂，唐明星，劉少華，李艷冰

[1. 中南大學湘雅醫院骨科脊柱外科，湖南 長沙 410008； 2. 國家老年疾病臨床醫學研究中心(湘雅醫院)，湖南 長沙 410008； 3. 中南大學湘雅醫院檢驗科，湖南 長沙 410008]

脊柱結核是結核分枝桿菌侵入椎體及附件引起的一類繼發性感染疾病。近年來，由于人口基數居高不下、人口流動率高以及耐藥菌的出現，脊柱結核發病率有回升的趨勢[1]。國內外臨床研究[2-3]顯示，脊柱結核患者骨質減少，骨質疏松發生率明顯高于正常人。目前引起脊柱結核患者骨質減少的病因尚未完全明確，有研究[3]顯示，脊柱結核患者骨質疏松的發生可能與患者成骨分化能力不足相關。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種存在于骨髓或骨膜中具有增殖分化為骨、軟骨、脂肪組織的潛能細胞，在細胞培養瓶中具有貼壁生長的趨勢。BMSCs是成骨細胞的前體細胞，在增殖分化之前需接受“指令”從而遷徙到目標位置[4]。BMSCs的遷徙能力是其成骨分化的前提條件，BMSCs遷徙能力受限將影響其成骨分化能力，并可能最終導致宿主骨質減少[5-6]。目前，針對脊柱結核患者BMSCs成骨分化的相關研究較少，結核分枝桿菌對宿主BMSCs遷徙能力的影響更鮮見報道。

本研究收集脊柱結核患者和對照人群的骨密度信息，并提取兩者的BMSCs，比較兩者BMSCs遷徙能力的差異，同時向BMSCs中加入卡介苗(BCG)進行共培養，模擬結核分枝桿菌感染環境，進一步觀察BMSCs遷徙能力的變化，以期闡明宿主因素和環境因素對BMSCs遷徙能力的影響，進而為脊柱結核患者骨代謝異常的相關研究提供方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年6月1日—2021年12月1日中南大學湘雅醫院脊柱外科住院確診為脊柱結核行脊柱內固定的患者為結核組，胸腰椎骨折或椎管狹窄行脊柱內固定的患者為對照組。本研究已獲得中南大學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①結核組需通過培養、Xpert等確診脊柱結核；②年齡18～75歲；③患者自愿接受骨密度測定。排除標準：①有吸煙、喝酒等不良嗜好者；②有風濕性疾病、自身免疫性疾病者；③垂體功能障礙者；④腫瘤患者或既往患腫瘤者。

1.3 儀器和試劑 BCG(成都生物制品研究所有限責任公司)、人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)、DMEM F12(1∶1)1×(Gibco，美國)、FBS(BI，以色列)、胰酶(0.25% TRYPSIN-EDTA，Gibco，美國)、雙能X線(型號：Discovery Wi S/N87047)。

1.4 骨密度測定 應用雙能X線掃描測量所有納入人群腰椎1～4(L1～4)骨密度(g/cm2)。

1.5 BMSCs的提取與培養 取結核組和對照組患者(各6例)手術時采集的釘道血2 mL，立即轉入無菌真空肝素管內，迅速置于二級生物安全實驗室內，用同等體積的生理鹽水稀釋。隨后將稀釋后的釘道血緩慢加至含有3 mL人外周血淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，使血液處于淋巴細胞分離液的上層。離心(10 min，1 000 g)后取中間白色云霧狀細胞層于另1支離心管中，加入DMEM F12(1∶1)1×稀釋后離心(10 min，1 000 g)，棄上清液，將離心管底部原代BMSCs用含15%FBS的DMEM F12(1∶1)1×的培養基重懸，移至細胞培養瓶中，并于37℃、5%CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁后每3天更換一次培養基，當單層細胞鋪滿培養瓶底90%后用胰酶(0.25% TRYPSIN-EDTA)傳代，并將原代BMSCs凍存于液氮內，后續傳代細胞用于正式試驗，BMSCs代數不超過4代。

1.6 細胞劃痕試驗 ①將每例患者第1代BMSCs接種于6孔板(1.3×104細胞/孔)中，用無抗生素的培養基培養，其中3孔加入BCG(1.3×105CFU/孔)，即為BCG共培養，3孔未加BCG者即為單純培養。②用劃痕細胞耙在每孔劃痕3條，BCG共培養和單純培養各3孔、9條劃痕，取9條劃痕細胞遷徙率的平均值用作后續統計分析。③用1 mL的基礎培養基清洗細胞3次，去除非貼壁細胞并使劃痕邊緣光滑；分別于0、第8小時、第16小時、第24小時用倒置顯微鏡拍攝(4×)細胞遷徙愈合圖像，用ImageView軟件測定每條劃痕的寬度，測定結果取平均值。

1.7 統計分析 應用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計數資料采用構成比描述，比較采用卡方檢驗；各組患者年齡和骨密度、BMSCs遷徙率比較采用ANOVA檢驗，成對比較采用LSD-t檢驗；使用Pearson相關系數分析骨密度和BMSCs遷徙率的相關性，以P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度檢測結果 結核組納入病例72例，對照組納入病例76例，兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.5)。結核組患者的骨密度低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者基本資料及骨密度檢測結果

2.2 BMSCs遷徙能力 兩組患者釘道血劃痕試驗結果顯示，在第8小時、第16小時結核組患者BMSCs遷徙率小于對照組(P<0.05)；在第24小時結核組BMSCs遷徙率數值仍小于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖1～2。

2.3 BCG對BMSCs遷徙能力的影響 結核組BCG共培養與單純培養比較，對照組BCG共培養與單純培養比較，不同時間BMSCs遷徙率差異均無統計學意義(均P>0.05)。在第8小時、第16小時，結核組BCG共培養BMSCs遷徙率低于對照組BCG共培養，差異具有統計學意義(P<0.05)；在第24小時，結核組BCG共培養與對照組BCG共培養BMSCs遷徙率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖1～2。

表2 兩組患者BCG共培養及單純培養不同時間BMSCs遷徙率(μm/h)

2.4 BMSCs遷徙率與骨密度相關分析 將BMSCs遷徙率與標本來源患者的椎體骨密度進行Pearson直線相關分析，結果發現，在第8小時、第16小時患者骨密度和患者BMSCs遷徙率相關系數(r值)分別為0.80、0.67(均P<0.05)；在第24小時兩者r值為0.51(P>0.05)。見圖3。

3 討論

本研究發現，相較胸腰椎骨折或椎管狹窄患者，脊柱結核患者骨密度明顯降低。脊柱結核患者骨質疏松的發生率明顯上升[3]，在脊柱結核小鼠模型中也發現結核小鼠骨小梁密度普遍降低[7]。結核分枝桿菌可降低成骨細胞骨保護素(OPG)的表達，增強核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達，且能誘導成骨細胞凋亡[8]。BMSCs作為成骨細胞的前體細胞，與脊柱結核患者的骨代謝密切相關。BMSCs可吞噬結核分枝桿菌造成持續感染狀態[9]，并使機體作出相應的免疫應答[10]。

BMSCs向病灶區域的遷徙和聚集，是啟動成骨分化的必要條件[11]。劃痕試驗是一種用于研究細胞遷移和細胞間相互作用的實驗室技術，通過半定量的方法來測定細胞遷徙率，從而反映細胞的遷徙能力強弱[12]。影響BMSCs遷徙的因素有很多：包括趨化因子[基質衍生因子-1(SDF-1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)]、細胞因子[骨調素(OPN)]和生長因子[轉化生長因子β1(TGF-β1)]等化學因素，以及生理循環靜水壓、流體剪切應力、骨基質形變和脈沖電磁場等物理因素[4]。影響BMSCs遷徙能力的因素，最終也會對BMSCs的成骨能力造成影響。本研究將患者BMSCs遷徙率與椎體骨密度進行Pearson直線相關分析發現，患者骨密度與BMSCs遷徙率之間具有相關性。關于BMSCs遷徙的研究逐漸成為了成骨機制研究的重點，但關于脊柱結核患者BMSCs遷徙能力的研究鮮有報道。

本研究中，脊柱結核患者BMSCs的遷徙能力低于對照組，此與脊柱結核患者骨密度降低、骨代謝紊亂的臨床表現相符合。在脊柱結核感染的過程中，病灶中的結核分枝桿菌是否會影響BMSCs遷徙能力的下降，從而造成脊柱結核患者成骨的減弱？為驗證此假設，研究將BCG和BMSCs共培養以模擬脊柱結核椎體病灶環境。共培養后的劃痕試驗表明，BCG的存在對BMSCs的遷徙能力影響并不明顯，可能與BCG致病力不足有關，但在共培養的條件下仍然觀察到脊柱結核患者BMSCs遷徙能力出現進一步下降的趨勢，與Rahyussalim等[13]在體外細胞試驗中結核分枝桿菌不影響BMSCs的生長和分化的結論一致。因此，推測結核分枝桿菌感染和結核病患者疾病嚴重程度的差異主要是因為宿主和環境因素，而結核分枝桿菌變異造成的影響較小[14]。結核病患者存在多個易感基因，宿主對于結核分枝桿菌感染的免疫反應受多個易感基因共同調控。Gao等[15]對208例脊柱結核患者和210名健康志愿者進行DNA測序分析后發現，MCP-1-2518 GG基因型和G等位基因的存在，可能與中國漢族人群對脊柱結核的易感性有關；2020年Xu等[16]研究表明，MC3R rs6127698基因的多態性與多灶性結核病的易感性有關；2013年郭超峰等[17]研究發現，單核細胞趨化蛋白1基因多態性、人血清中單核細胞趨化蛋白1的表達水平與脊柱結核易感性相關；最近，Li等[18]研究表明，SLC11A1 rs17235409基因的多態性與脊柱結核的易感性有關。

本試驗存在以下不足：①共培養使用的是無毒的BCG，而不是結核分枝桿菌強毒株，可能對試驗結果產生一定影響。但無毒的BCG抗原性和強毒株一致，且研究[19]表明BCG和結核分枝桿菌強毒株引起某些細胞因子、生長因子升高的水平差異無統計學意義；Inoue等[20]研究也曾使用BCG代替結核分枝桿菌進行研究，因此本試驗共培養也采用BCG模擬脊柱結核椎體病灶環境。②本研究基于現有條件只采集了6對BMSCs進行試驗，在一定程度上可能存在偏倚。

綜上所述，本研究在臨床上發現脊柱結核患者骨密度降低，提出脊柱結核分枝桿菌感染影響BMSCs遷徙能力的假設，從而研究脊柱結核患者BMSCs遷徙能力的改變以及BCG對于脊柱結核患者BMSCs遷徙率的影響，并通過已有的樣本分析骨密度與BMSCs遷徙率的相關性。本組研究發現，脊柱結核患者BMSCs遷徙率減低，BCG對BMSCs的遷徙能力無明顯影響，且骨密度與BMSCs遷徙率之間具有相關性。結果提示脊柱結核患者骨密度降低與BMSCs遷徙能力的減低存在相關性，但暴露于結核分枝桿菌抗原并不引起BMSCs遷徙能力減低，推測脊柱結核患者BMSCs遷徙能力的減低主要與宿主自身因素相關，而結核分枝桿菌的影響較弱。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。