不同方法在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原學(xué)診斷中的價(jià)值

曾國(guó)芬，李曉杰，梁家隱，韓翔飛，雷姿穎，徐樂(lè)加，陳蘭停，胡 波，高志良，劉 靜

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1. 感染科； 2. 檢驗(yàn)科； 3. 藥劑科，廣東 廣州 510630)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)感染是常見(jiàn)的致殘、致死性疾病，2017年全球患病人數(shù)約有1 730萬(wàn)例，傷殘生活年數(shù)超過(guò)145萬(wàn)[1]。高效、準(zhǔn)確的病原體診斷是正確治療的前提[2]，在CNS感染的診治中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，常規(guī)的病原體檢測(cè)技術(shù)，如直接鏡檢(革蘭染色、墨汁染色等)、細(xì)菌/真菌培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)、傳統(tǒng)核酸檢測(cè)具有敏感性低、特異性差、通量低等缺點(diǎn)，難以滿足臨床的需求。文獻(xiàn)報(bào)道，幾乎有一半的腦膜腦炎患者沒(méi)有確定病因[3]，無(wú)明確病原體腦炎的病例更是高達(dá)69.8%[4]。快速分子診斷是新興的病原體診斷技術(shù)，具有檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)單，可有效提高病原體診斷及指導(dǎo)抗微生物治療等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)宏基因組第二代測(cè)序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)廣泛運(yùn)用于臨床，提高了診斷水平，但存在缺乏檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、耗時(shí)長(zhǎng)、背景菌干擾大等困境[5]。FilmArray meningitis/encephalitis (FA ME) panel是一款基于多重PCR (polymerase chain reaction)原理的自動(dòng)化快速分子診斷設(shè)備，可在1 h檢測(cè)14種最常見(jiàn)的急性CNS感染病原體。2015年FA ME被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，目前已在國(guó)外多個(gè)國(guó)家使用，但在我國(guó)大陸的使用較少。本研究以某院收治的疑似CNS感染患者為研究對(duì)象，回顧性分析FA ME及mNGS在CNS感染病原體診斷的效果，并結(jié)合細(xì)菌/真菌培養(yǎng)、病毒核酸/血清學(xué)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，幫助臨床醫(yī)生正確認(rèn)識(shí)以上方法的檢測(cè)性能，提高CNS感染的診斷水平。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究為單中心、回顧性、觀察性研究。以2020年6月—2021年1月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院收治的疑似CNS感染患者為研究對(duì)象，采取以下納入與排除標(biāo)準(zhǔn)收集腦脊液(CSF)標(biāo)本進(jìn)行FA ME檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)有CNS感染的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、頭痛、嘔吐或意識(shí)改變，神經(jīng)定位體征等；(2)患者均已進(jìn)行入院常規(guī)檢測(cè)，如血常規(guī)、炎性指標(biāo)、CSF常規(guī)及生化、CSF涂片或培養(yǎng)等項(xiàng)目；(3)CSF常規(guī)顯示白細(xì)胞(WBC)升高；(4)主管醫(yī)生認(rèn)為不能排除CNS感染的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：外傷導(dǎo)致的CNS感染。病原學(xué)診斷細(xì)菌、真菌以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，病毒以病毒核酸或血清學(xué)檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)。研究最終納入患者29例。所有的檢測(cè)結(jié)果均由主管醫(yī)療組醫(yī)生根據(jù)患者臨床情況(癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查及治療反應(yīng)等)進(jìn)行分析，作出最終診斷。本項(xiàng)目遵循的程序符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，已通過(guò)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)為：中大附三醫(yī)倫[2020]02-130-01，臨床試驗(yàn)注冊(cè)號(hào)為ChiCTR2000038045。

1.2 FA ME panel FA ME panel是利用巢式多重PCR技術(shù)進(jìn)行的一站式多重病毒體分子檢測(cè)系統(tǒng)。該設(shè)備集核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)為一體，同時(shí)檢測(cè)14種常見(jiàn)CNS感染的病原體，包括6種細(xì)菌(大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、無(wú)乳鏈球菌、肺炎鏈球菌)，1種真菌(新生隱球菌)和7種病毒(巨細(xì)胞病毒、腸病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人皰疹病毒6型、人雙埃可病毒、水痘帶狀皰疹病毒)。本研究嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)使用FA ME進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 mNGS 本研究的mNGS檢測(cè)結(jié)果來(lái)自于金域、予果生物、杰毅生物等測(cè)序公司。基本檢測(cè)流程包括標(biāo)本采集、核酸提取、文庫(kù)建立和生物信息學(xué)分析。mNGS結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考既往文獻(xiàn)[6]。

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢查 所有入組患者由主管醫(yī)生根據(jù)臨床情況安排入院常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，包括血常規(guī)、炎性指標(biāo)、血清學(xué)檢測(cè)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)核酸、EB病毒核酸、CSF常規(guī)、CSF生化、隱球菌抗原、CSF涂片或培養(yǎng)等項(xiàng)目。各檢測(cè)項(xiàng)目均根據(jù)規(guī)范的檢測(cè)流程在醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。患者臨床特征、病原體檢出情況采用例數(shù)及百分比表示，組間差異比較采用Fisher’s確切概率檢驗(yàn)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料 29例CNS疑似感染患者，男性23例(79.3%)，24例(82.8%)患者年齡≥18歲。29例患者均進(jìn)行FA ME檢測(cè)，1例為無(wú)效檢測(cè)。22例患者完成了mNGS檢測(cè)。所有患者根據(jù)臨床需要接受入院血常規(guī)、炎性指標(biāo)、血清學(xué)、核酸、CSF常規(guī)及生化、CSF涂片或培養(yǎng)等院內(nèi)檢測(cè)。29例患者進(jìn)行腰穿，其中22例(75.9%)患者在腰穿前使用了抗菌藥物。26例(89.7%)患者為社區(qū)獲得CNS感染，3例(10.3%)為醫(yī)院術(shù)后相關(guān)感染。臨床特征資料見(jiàn)表1。

表1 29例CNS患者臨床特征

2.2 病原體檢出情況 FA ME、mNGS細(xì)菌陽(yáng)性率分別為7.1%、9.1%，數(shù)值高于細(xì)菌培養(yǎng)(3.4%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。FA ME檢出的病原體分別為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(2株)、大腸埃希菌(1株)、肺炎鏈球菌(1株)，其中2株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌經(jīng)臨床綜合判斷后為假陽(yáng)性。mNGS分別檢出肺炎鏈球菌、草分枝桿菌、無(wú)乳鏈球菌各1株,其中草分枝桿菌經(jīng)臨床判斷為污染菌。培養(yǎng)獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌及模仿葡萄球菌各1株，結(jié)合臨床判斷藤黃微球菌、模仿葡萄球菌為污染菌。1例患者mNGS及細(xì)菌培養(yǎng)陰性，F(xiàn)A ME檢出大腸埃希菌，符合患者病情，判斷為感染病原體。

真菌方面，F(xiàn)A ME、mNGS陽(yáng)性率分別為10.7%、13.6%，均低于真菌培養(yǎng)(17.2%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。FA ME及培養(yǎng)檢出的真菌均為隱球菌，mNGS檢出隱球菌外，有1株為念珠菌屬。其中念珠菌屬經(jīng)臨床判斷為假陽(yáng)性。FA ME未檢出的病例為隱球菌負(fù)荷最低的2例患者。

FA ME、mNGS對(duì)于病毒陽(yáng)性率分別為3.6%、18.2%，高于院內(nèi)病毒核酸/血清學(xué)檢測(cè)(0)。FA ME檢出巨細(xì)胞病毒(CMV)及單純皰疹病毒2型各1株，其中CMV結(jié)果經(jīng)臨床綜合判斷后為假陽(yáng)性。mNGS分別檢出CMV 4株，人類(lèi)(伽馬)皰疹病毒4型、EB病毒及鼻病毒B各1株。其中2株CMV經(jīng)臨床判斷為假陽(yáng)性。1例患者mNGS及院內(nèi)病毒核酸/血清學(xué)檢測(cè)均為陰性，F(xiàn)A ME檢出單純皰疹病毒2型，經(jīng)臨床判斷符合患者病情，判斷為感染病原體。3例患者FA ME及院內(nèi)病毒核酸/血清學(xué)檢測(cè)為陰性,mNGS分別人類(lèi)(伽馬)皰疹病毒4型、鼻病毒B和CMV，經(jīng)臨床判斷為感染病原體。見(jiàn)表2、3。

表2 FA ME、mNGS、金標(biāo)準(zhǔn)方法病原體檢出情況

同時(shí)完成FA ME、mNGS和院內(nèi)檢測(cè)三種方法的21例患者，2例檢出隱球菌，11例檢測(cè)結(jié)果為陰性，三種檢測(cè)方法結(jié)果一致。

表3 FA ME、mNGS、金標(biāo)準(zhǔn)方法病原體檢出率

3 討論

CNS感染是臨床的危急重癥，標(biāo)本采集前普遍使用抗菌藥物，加之CSF中病原菌負(fù)荷本身較低，傳統(tǒng)的院內(nèi)檢測(cè)病原體方法確診率很不理想。快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷是目前研究的重要方向。近年來(lái)，一系列快速分子診斷設(shè)備的涌現(xiàn)使得許多疑難的、新的病原體診斷成為可能。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)A ME在CNS感染病原體診斷中具有積極的作用。3例患者院內(nèi)檢測(cè)陰性，而FA ME檢測(cè)明確了病原體，分別為大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、單純皰疹病毒2型感染。

病原學(xué)快速診斷使早期的特異性治療成為可能，雖然FA ME很有吸引力，但需要注意假陽(yáng)性及假陰性的情況。文獻(xiàn)[7]報(bào)道，F(xiàn)A ME檢出1型單純皰疹病毒假陽(yáng)性，導(dǎo)致結(jié)核性腦膜炎病例誤診為病毒性腦炎而延誤病情。本研究結(jié)果亦顯示，F(xiàn)A ME檢出的2株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌及1株CMV經(jīng)臨床認(rèn)定為假陽(yáng)性。研究[3,8-9]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A ME在隱球菌診斷方面出現(xiàn)假陰性，甚至在隱球菌抗原、涂片及培養(yǎng)均獲得陽(yáng)性結(jié)果的病例中仍未能檢出隱球菌。本組5例隱球菌感染病例中，F(xiàn)A ME檢出率為60.0%，培養(yǎng)陽(yáng)性率為60.0%，墨汁染色及隱球菌抗原陽(yáng)性率均高達(dá)100%。因此，當(dāng)懷疑隱球菌性腦膜炎時(shí)，建議使用細(xì)菌涂片、培養(yǎng)作為首選的檢查方法。另一方面，F(xiàn)A ME包含自動(dòng)化報(bào)告輸出系統(tǒng)，檢測(cè)完成后可自動(dòng)報(bào)告結(jié)果，有研究發(fā)現(xiàn)自動(dòng)化報(bào)告存在假陰性[10]。本組病例檢測(cè)過(guò)程中有3例(1例大腸埃希菌及2例產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌)原始報(bào)告呈假陰性。臨床實(shí)踐中不應(yīng)盲目相信FA ME報(bào)告系統(tǒng)輸出的結(jié)果，而應(yīng)檢查每個(gè)病原體靶標(biāo)的溶解曲線后作出最后結(jié)論，必要時(shí)復(fù)查。特別是對(duì)于免疫抑制患者，F(xiàn)A ME的數(shù)據(jù)目前尚缺乏，在FA ME出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)注意甄別是否為責(zé)任病原菌，而結(jié)果為陰性時(shí)也應(yīng)慎重下結(jié)論，避免假陰性，不應(yīng)盲目減少經(jīng)驗(yàn)性治療，以免延誤病情[7,11]。

本研究顯示，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌及CMV是CNS感染中假陽(yáng)性率最高的病原體。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種革蘭陽(yáng)性桿菌，是重要的食源性病原體，可導(dǎo)致多種臨床綜合征，包括母嬰感染、敗血癥和CNS感染等[12]。神經(jīng)李斯特菌病是致命的CNS感染，研究顯示僅39%的神經(jīng)李斯特菌病患者存活并完全康復(fù)，長(zhǎng)期的后遺癥超過(guò)了細(xì)菌性腦膜炎和感染性腦炎[12-14]。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌對(duì)頭孢類(lèi)抗生素天然耐藥，常規(guī)針對(duì)腦膜炎的經(jīng)驗(yàn)性治療不能充分治療該菌引起的顱內(nèi)感染，而傳統(tǒng)培養(yǎng)的陽(yáng)性率低[15]，臨床表現(xiàn)缺乏特異性[12]，故神經(jīng)李斯特菌病的診斷常常面臨困境。有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)A ME檢測(cè)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌病原是特別有利的，因?yàn)獒槍?duì)這些病原體的PCR檢測(cè)在其他商業(yè)檢測(cè)方法中不常用[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，培養(yǎng)陰性的CNS感染，F(xiàn)A ME快速診斷出產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌腦干腦炎，進(jìn)而及時(shí)采用特異性的抗菌治療挽救了患者生命，同時(shí)減少了不必要的抗菌藥物暴露[15]。然而，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌廣泛存在于自然界中，腰穿操作、標(biāo)本檢測(cè)等過(guò)程中均可能受到環(huán)境污染，本研究中FA ME檢出的2株李斯特菌均被證實(shí)為污染菌，無(wú)特異性抗李斯特菌治療即好轉(zhuǎn)。因此，臨床實(shí)踐中應(yīng)特別注意結(jié)合臨床和檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行綜合判斷。

CMV易引起潛伏感染，故CSF中容易被檢測(cè)到。CSF中CMV的檢出可能為原發(fā)感染，亦可能是潛伏感染或感染的再激活[16]，是否為真正的責(zé)任病原體需綜合臨床情況。事實(shí)上，F(xiàn)A ME中的皰疹病毒，包括單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、CMV、水痘-帶狀皰疹病毒、人皰疹病毒6型均可出現(xiàn)類(lèi)似假陽(yáng)性的情況，臨床實(shí)踐中應(yīng)注意甄別[16]。另一方面，Hanson等[17]曾報(bào)道FA ME出現(xiàn)CMV假陰性的情況。本研究中有1例病例FA ME檢測(cè)CMV陰性，mNGS檢測(cè)陽(yáng)性，而結(jié)合臨床最終考慮為CMV腦膜腦炎。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A ME的病毒檢測(cè)敏感性低于單基因PCR檢測(cè)[18]，因此，推測(cè)該假陰性的結(jié)果可能由樣本中病毒載量低導(dǎo)致，亦可能受限于FA ME對(duì)病毒的檢測(cè)性能[19]。

FA ME主要針對(duì)社區(qū)獲得性CNS感染病原體，不適合用于院內(nèi)感染的CSF標(biāo)本[20]，有學(xué)者認(rèn)為醫(yī)院或術(shù)后腦膜炎的患者不應(yīng)進(jìn)行FA ME檢測(cè)[7]。本組3例醫(yī)院獲得的CNS感染病例FA ME檢測(cè)均為陰性，亦支持該觀點(diǎn)。

mNGS是目前臨床上廣泛使用的新型病原學(xué)診斷手段。通過(guò)對(duì)臨床樣本的DNA或RNA進(jìn)行鳥(niǎo)槍法測(cè)序，可以無(wú)偏倚地檢測(cè)多種病原微生物，但因價(jià)格較高，操作過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)流程及結(jié)果判讀缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等原因，導(dǎo)致推廣受到一定的限制。尚無(wú)官方機(jī)構(gòu)正式批準(zhǔn)的適應(yīng)證及推薦領(lǐng)域,結(jié)果原則上需要其他方法驗(yàn)證，不能單獨(dú)作為病原學(xué)確診或排除的證據(jù)[21]。在CNS感染中，mNGS已成功檢測(cè)到多種新發(fā)及少見(jiàn)病原體，提高了病原體的檢出率[22]，目前被推薦為急性CNS感染的二線首選及慢性CNS感染的首選檢測(cè)手段[23]。本研究結(jié)果顯示，mNGS較細(xì)菌培養(yǎng)具有更高的陽(yáng)性率，尤其在病毒檢測(cè)方面優(yōu)勢(shì)突出，但亦存在假陰性的情況(單純皰疹病毒2型、大腸埃希菌及隱球菌)。因此臨床實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)患者的病情個(gè)體化選擇檢測(cè)方案。

以往研究FA ME在浙江及上海醫(yī)療機(jī)構(gòu)收治的兒童(小于18歲)CNS感染診斷中的效果，顯示FA ME在CNS感染診斷中的運(yùn)用前景[24-25]。本研究對(duì)象多來(lái)自成人，82.8%患者大于18歲，且來(lái)自南方地區(qū)，是FA ME在大陸真實(shí)世界中為數(shù)不多的實(shí)踐研究。如今mNGS在我國(guó)已廣泛應(yīng)用，本研究結(jié)合mNGS進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)一步提高了研究的實(shí)用性，研究結(jié)果具有較好的臨床借鑒作用。

單中心、回顧性研究及樣本量小是本研究的不足。納入的29例可疑CNS感染患者接受了FA ME檢測(cè)和院內(nèi)常規(guī)檢測(cè)，僅22例進(jìn)行mNGS檢測(cè)。另外，本研究來(lái)自真實(shí)世界臨床實(shí)踐，納入的病例來(lái)自全院不同科室，進(jìn)行mNGS檢測(cè)的公司不盡相同，測(cè)序平臺(tái)、核酸提取試劑及判斷閾值均可能存在差異，因此，本研究結(jié)果有賴(lài)于后續(xù)開(kāi)展大樣本量前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，F(xiàn)A ME、mNGS可作為傳統(tǒng)檢測(cè)的補(bǔ)充手段提高CNS感染病原體檢出水平。鑒于CNS感染的嚴(yán)重性及復(fù)雜性，臨床醫(yī)生應(yīng)綜合臨床情況個(gè)體化選擇檢測(cè)方法，并注意對(duì)結(jié)果的正確解讀。

致謝：感謝患者的理解及生物梅里埃公司的技術(shù)支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。