外周血循環腫瘤細胞、人附睪蛋白4、糖類抗原199檢測在子宮內膜樣腺癌篩查及分期預測中的價值*

游偉強，吳小延，葉才果，王莉平△，林立鵬，薛臨先，肖 楊

1.深圳市福田區婦幼保健院檢驗科，廣東深圳518016；2.中山大學腫瘤防治中心分子診斷科， 廣東廣州 510060；3.廣東醫科大學廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞523808

子宮內膜癌是一種發生在子宮內膜上皮的惡性腫瘤，以子宮內膜樣腺癌最為常見，其在子宮內膜癌中占80%～90%[1]。近年來，子宮內膜樣腺癌呈現出發病年齡年輕化、發病率逐年上升的趨勢[2]。全球每年新發子宮體癌約25萬例，其中約75%為子宮內膜癌。在子宮內膜樣腺癌早期，患者可無任何臨床癥狀，即使其最常見的臨床表現——陰道不規則流血和陰道分泌物增多，也不具備特異性。陰道超聲檢查可對子宮內膜樣腺癌作出初步篩查，但是誤診、漏診率較高。磁共振成像(MR)和腹部計算機斷層掃描(CT)對于判斷子宮內膜樣腺癌的轉移具有較好的臨床價值。傳統的血液腫瘤標志物的整體綜合診斷性能不足，而診斷性刮宮和宮腔鏡下活檢是侵入性操作，易對患者的生理和心理產生影響，而且容易導致腫瘤的種植性轉移[3]。目前鮮有敏感而特異的無創篩查技術可用于子宮內膜樣腺癌的早期診斷及分期預測。

液態活檢技術的發展及外周血循環腫瘤細胞(CTC)的發現為解決這一學科難題帶來了希望。CTC檢測具有無創性、綜合效能較高、早于影像學檢測和可重復性強等優點。2010年以來，CTC的臨床價值陸續得到了國內外眾多權威學會和指南的認可，應用于多種癌癥的早期診斷、治療監測、復發監測和指導治療方案[4]。此外，DEGEZ等[5]研究發現，人附睪蛋白4(HE4)對子宮內膜樣腺癌的早期篩查及分期預測可能有一定的參考價值。李小毛等[6]研究認為，術前糖類抗原199(CA199)檢測是預測子宮內膜癌的病理高危因素和手術病理分期的良好指標。本研究旨在分析術前CTC、HE4、CA199聯合檢測在子宮內膜樣腺癌篩查和分期預測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2022年1月于中山大學腫瘤防治中心就診或體檢的293例子宮內膜正常體檢者(正常組)、359例無非典型性子宮內膜增生患者(良性組)、381例子宮內膜樣腺癌患者(惡性組)作為研究對象。正常組年齡24.5～82.6歲，平均(52.9±9.6)歲。良性組年齡22.7～81.2歲，平均(53.1±10.8)歲。惡性組年齡26.5～83.4歲，平均(53.5±11.6)歲。正常組、良性組和惡性組的年齡比較，差異無統計學意義(F=0.28，P=0.76)。納入標準：年齡20～85歲；子宮內膜為原發病灶；患者依從性好且病歷資料詳細；無孕激素拮抗的性激素治療史；未合并其他腫瘤。排除標準：妊娠期、哺乳期女性；有放化療、免疫治療史者；合并血液系統嚴重疾病者；精神疾病患者；因各種原因中途退出研究者。良性組、惡性組的病理診斷依據是2020年第5版世界衛生組織推薦的子宮體癌分類標準[7]。采用2018年國際婦產科聯盟推薦的手術病理分期標準[8]，把惡性組381例子宮內膜樣腺癌患者分為Ⅰ期(261例)、Ⅱ期(41例)、Ⅲ期(43例)、Ⅳ期(36例)。陽性病例是經病理學檢查確診為子宮內膜樣腺癌的381例患者，陰性病例包括293例正常組受試者和359例良性組患者，共652例受試者。

1.2試劑與儀器 CTC檢測試劑盒和PathfinderTM全自動智能掃描圖像分析系統均購于江蘇萊爾生物醫藥科技有限公司，HE4、CA199檢測試劑盒和Cobas E 801電化學發光免疫分析儀均購于羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.3方法 分別于正常組受試者體檢時、良性組和惡性組患者術前采集4.0 mL靜脈血液標本各2份。一份用于CTC檢測，另一份用于HE4、CA199水平檢測。(1)CTC檢測及結果判讀：按照CTC檢測說明書操作，采用“陰性富集法”以CS1緩沖液、CS2儲存液、CS3分離介質和磁微粒混懸液，3 000 r/min離心8 min，離心半徑為15 cm，采用免疫磁微粒技術分離血漿、去除破裂紅細胞和白細胞，得到白細胞去除率大于99.99%、CTC回收率大于90%的細胞懸液。借助全自動智能掃描圖像分析系統，使用熒光原位雜交技術，排除其他的血源性細胞，鑒定細胞懸液中的CTC。CTC數量在0～1個為正常，判讀為陰性，CTC數量在2個及以上，判讀為陽性。(2)HE4、CA199檢測及結果判讀：按照HE4、CA199檢測說明書操作，血液標本以3 000 r/min離心8 min，取上層血清液，測定HE4、CA199水平。HE4參考范圍為0～140 pmol/L、CA199參考范圍為0～27 U/mL。HE4、CA199兩項指標檢測值大于參考范圍上限，定義為陽性。(3)CTC、HE4、CA199聯合檢測及結果判讀：聯合檢測組合結果判讀采用平行試驗，即CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測結果中只要有一個試驗為陽性即診斷為該檢測組合陽性，全部試驗結果都為陰性時診斷為陰性。

2 結 果

2.13組CTC數量及HE4、CA199表達水平比較 3組CTC數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；惡性組CTC數量高于良性組和正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；良性組和正常組的CTC數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。3組HE4表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；惡性組HE4表達水平高于良性組和正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；良性組和正常組HE4表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。3組CA199表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；惡性組CA199表達水平高于良性組和正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；良性組和正常組CA199表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組CTC數量及HE4、CA199表達水平比較[M(P25,P75)]

2.23組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率比較 3組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率總體差異均有統計學意義(P<0.05)。惡性組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率高于良性組和正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；良性組和正常組HE4、CA199、CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測的陽性情況比較[n(%)]

2.3惡性組各分期的CTC數量及HE4、CA199表達水平比較 惡性組各分期CTC數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期CTC數量兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。惡性組各分期的HE4表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期、Ⅱ期與Ⅳ期、Ⅲ期與Ⅳ期HE4表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。惡性組各分期的CA199表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 惡性組各分期的CTC、HE4、CA199表達水平比較[M(P25,P75)]

2.4惡性組各分期CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率比較 惡性組各分期的CTC檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。惡性組各分期HE4檢測陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=1.24，P=0.74)；惡性組各分期CA199檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CA199檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。惡性組各分期CTC+HE4檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC+HE4檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。惡性組各分期HE4+CA199檢測陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=1.52，P=0.68)。惡性組各分期CTC+CA199檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。Ⅰ期與Ⅲ期、Ⅰ期與Ⅳ期CTC+CA199檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。惡性組各分期CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ期與Ⅳ期CTC+HE4+CA199檢測陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 惡性組各分期的CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率比較[n(%)]

2.5CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測對子宮內膜樣腺癌的診斷效能 對單因素分析差異有統計學意義的CTC、HE4、CA199檢測指標的原始值繪制相應的ROC曲線，在擬合了CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測的Logistic回歸模型后，使用其P值繪制相應檢測的ROC曲線。ROC曲線分析結果顯示，CTC+HE4+CA199聯合檢測的曲線下面積(AUC)最大[0.945(95%CI：0.932～0.959)]，檢測靈敏度和特異度分別為87.93%、92.79%。CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測子宮內膜樣腺癌的ROC曲線及相關參數見表5和圖1。

表5 CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測診斷子宮內膜樣腺癌的ROC曲線相關參數

圖1 CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測診斷子宮內膜樣腺癌的ROC曲線

3 討 論

近年來，子宮內膜癌的病死率每年上升約1.4%，Ⅰ期患者5年生存率約90%，Ⅱ期約40%、Ⅲ期和Ⅳ期則降至20%以下[9]。因此，早期診斷有益于改善子宮內膜樣腺癌患者生存率。CHU等[10]研究表明，CTC以不同形態存在于上皮細胞表型、間質細胞表型，以及上皮細胞和間質細胞混合表型。本研究中采用的檢測技術能高效進行CTC的鑒定，該技術不依賴CTC的理化特性，能有效將上皮細胞表型、間質細胞表型及混合表型捕獲。本文與陳志強等[11-12]研究使用了相同的檢測技術。KISS等[13]研究表明，子宮內膜癌患者中CTC的存在提示其總體生存率較差。本研究側重于探討CTC在子宮內膜樣腺癌篩查和分期預測中的應用價值。

本研究結果顯示，3組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測的陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而且惡性組CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測陽性率均高于良性組和正常組，差異有統計學意義(P<0.01)；3組CTC數量及HE4、CA199表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)，惡性組CTC數量及HE4、CA199表達水平均高于良性組和正常組，差異均有統計學意義(P<0.01)。本研究中，表1和表2通過單因素分析，甄選出了CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測中對惡性組篩查有統計學意義的檢測組合。這與TINGANELLI等[14]、DEGEZ等[5]、李小毛等[6]研究報道的結論基本一致。本研究聯合了CTC液態活檢技術與傳統的血液腫瘤標志物HE4和CA199這3項檢查指標。

本研究從檢測陽性率和表達水平兩個方面考察CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測對惡性組的分期預測價值，結果顯示CTC、CA199、CTC+HE4、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199檢測陽性率對于甄別惡性組各分期差異有統計學意義(P<0.05)，CTC數量及HE4表達水平對于甄別惡性組各分期差異有統計學意義。本研究中，表3和表4通過單因素分析甄選出了CTC、HE4、CA199單獨和聯合檢測中對惡性組分期具有預測價值的檢測組合。ZHANG等[15]檢測了78例Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期子宮內膜癌患者血液中的CTC，表明CTC對于子宮內膜癌預后和轉移具有預測價值。ESPIAU等[16]研究認為，腫瘤標志物HE4可以預測子宮內膜癌的淋巴結轉移情況。AREND等[17]研究發現，CA199對于提示子宮內膜癌的臨床分期和淋巴結轉移均有一定的臨床意義。而本研究正常組和良性組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期CA199差異的判斷與AREND等[17]研究結論有不同之處，可能是由于本文樣本量偏小引起的。本研究中，ROC曲線分析結果顯示，CTC+HE4+CA199檢測的AUC最大，靈敏度、符合率、約登指數等高于其他檢測組合。因此，CTC+HE4+CA199對子宮內膜樣腺癌的綜合診斷價值較高。

由于受研究時間及樣本量的影響，本研究結論還需進一步驗證。本課題組今后將繼續加強與上級醫療機構的合作，擴大樣本量，深入研究CTC、HE4、CA199與子宮內膜樣腺癌的腫瘤分級、肌層浸潤、淋巴結轉移及分子分型等的相關性，更好地掌握子宮內膜樣腺癌的特征和發生、發展機制，制訂個體化診治方案，造福患者。