同時檢測速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分實時熒光聚合酶鏈式反應方法的建立及應用

周 藏，孫曉霞，王金鳳，付 琦，王愷睿，劉立兵,*，王建昌,*

（1.河北醫科大學公共衛生學院，河北 石家莊 050017；2.石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050051；3.河北省環境與人群健康重點實驗室，河北 石家莊 050017）

快節奏的現代生活中，速凍食品因其種類繁多、滋味豐富、烹飪方式簡單、省時等優勢，已成為人們日常生活中不可或缺的一種食品類型。但隨著人們對速凍食品的需求日益增多，速凍食品市場變得魚龍混雜，有關速凍食品肉類摻假或標注肉的種類與實際不符的報道層出不窮，給市場監管帶來了極大挑戰，如牛肉風味的撒尿肉丸未添加牛肉，6 元/kg的豬肉水餃實際上內餡為雞架泥等。目前，主要的肉類摻假方式為以價格低廉的雞肉、鴨肉和豬肉代替市場價格更高的牛羊肉，這種摻假售假的行為不僅侵犯了消費者的合法權益，還存在導致消費者違背民族飲食習慣和發生過敏的可能，給消費者的身心健康帶來了極大的安全隱患。因此，亟需一種快速、有效的檢測手段來鑒別速凍食品的動物源性成分，促進監管部門對速凍食品生產原材料的品質和食品標簽的真實性進行有力監管，維護消費者的合法權益。

肉制品中動物源性成分的檢測方法主要有基于特征結構檢測的光譜和質譜分析、基于蛋白質檢測的免疫學方法和基于核酸檢測的分子生物學方法。與其他方法相比，分子生物學方法受加工處理方式的影響較小，且方法特異性、靈敏性高，操作簡單，因此成為肉制品中動物源性成分檢測方法的研究熱點。目前，國內外學者針對動物源性成分核酸檢測建立了等溫擴增技術和熱循環擴增技術。等溫擴增技術作為一種新興技術，包括環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法和重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）法等，其中LAMP方法引物設計較為復雜，假陽性率較高；RPA方法引物、探針設計較為困難，成本高，不適合大量樣品多種源性成分的同時檢測。熱循環擴增技術包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reation，PCR）方法、實時熒光PCR方法、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法和微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）法等，RFLP方法重復性較差，不適用于復雜成分的肉制品分析；ddPCR是一種絕對定量檢測技術，但該方法所用試劑昂貴、檢測成本較高，對操作人員的專業素質要求較高，不適用于大范圍推廣；而基于實時熒光PCR技術建立的動物源性成分檢測方法克服了傳統PCR技術易造成交叉污染的缺點，廣泛應用于肉制品中動物源性成分的摻假鑒別。但我國應用實時熒光PCR技術建立的多種動物源性成分檢測的國家或行業標準，主要是針對單一物種成分的定性鑒定，不能同時檢測多種源性成分。在實際檢測工作中，往往需要在短時間內對一種食品完成多種源性成分檢測，以鑒別是否摻假；然而，目前單一物種的定性檢測方法耗時較長，已經不能滿足市場檢測需求。

目前，市面上速凍食品的種類主要包括速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等，成分表中肉類以雞肉、鴨肉、豬肉和牛肉為主。雞轉化生長因子β-3（transforming growth factor beta-3，）基因、豬朊蛋白（prion protein，）基因和鴨、牛生長激素（growth hormone，）基因是雞、鴨、豬和牛源性成分檢測中常用的單拷貝基因，不僅在源性成分定性檢測方面表現出良好的靈敏性，而且由于單拷貝基因在每個細胞內拷貝數固定的優勢，在后續源性成分定量檢測方面也具有極大應用潛力。故本研究基于雞基因、豬基因和鴨、牛基因，設計合成特異性引物和Man探針，建立同時檢測速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的實時熒光PCR檢測方法，實現4 種源性成分的快速檢測。進一步運用所建立的方法對市售不同種類的速凍食品進行雞、鴨、豬和牛源性成分檢測，驗證該方法的有效性和實用性。

隧道工程支護施工技術科學合理準確的使用是保證隧道安全施工作業的基礎性條件。大家知道，隧道內部的排水系統的施工難度是非常大的，而且施工的綜合性比較強，因此隧道結構防水技術的合理準確的應用要根據施工現場的實際情況而定。通常隧道結構防水的基本原則是“防水、排水、堵水相結合”，常用的施工方法就是在隧道洞的兩側挖掘排水渠、在隧道洞口上方建造截水溝，在隧道內部水溝的出水位置安裝保溫包頭。同時還要密切關注隧道施工縫、變形縫處的排水系統的設計和建造工作。

[26] David Lawder, “China will Get Better U. S. Trade Deal If It Solves North Korea Problem: Trump”, The Reuters, April 11, 2017, http://www.businessinsider.com/r-china-will-get-better-us-trade-deal-if-it-solves-north-korea-problem-trump-2017-4.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞、鴨、豬、牛、狐貍、水貂、鵝、驢、羊、馬幾種不同動物肉粉由本實驗室制備并保存；速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等34 份速凍食品，均購于石家莊市不同農貿市場或超市。

將購買的34 份速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅解凍至室溫，使用無菌剪刀將待測樣品的面皮和肉餡分離，挑取適量肉餡置于研缽中，加入液氮充分研磨成粉末。取50 mg樣品粉末于1.5 mL離心管中，每份樣品取2 管，分別按照1.3.2節提取基因組DNA。樣品處理和核酸提取過程中應避免樣品之間或與其他動物源性成分的交叉污染。采用建立的實時熒光PCR方法對所有樣品同時檢測雞、鴨、豬和牛源性成分。將檢出的動物源性成分與樣品外包裝標注的成分進行比對，對檢測結果進行分析，進一步驗證所建立方法的準確性和實際應用效果。

主成分分析圖可以直觀地反映出各樣品的相對位置及與感官特征的相關關系，樣品之間、樣品與感官特征之間的相對位置越近，表明它們在風味特征上，關系越密切[27]，16種怪味胡豆樣品與風味特征在F1/F2坐標中的分布，見圖1。

線下：分類教學+課堂精講+小班研討+應用實驗+結課考核。學生在教師引導下，開展研討式、探索式和協作式的學習活動，開展“大班授課，小班討論”的教學方式，為學生課內交流和展現成果提供機會。

1.2 儀器與設備

1-14臺式離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；ABI 7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司；SL 202電子天平 德國賽多利斯公司；BT-20T恒溫金屬浴 上海安亭儀器有限公司。

食品基因組DNA提取試劑盒 美國Promega公司；探針法熒光PCR預混液（2×） 北京全式金生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針

參考文獻[25-26]合成雞基因和鴨基因特異性引物和探針；參照GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實時熒光PCR法》，合成豬基因及牛基因特異性引物和探針；所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示。

表1 所需引物和探針序列信息Table 1 Information about the primers and probe used in this study

1.3.2 動物肉粉基因組DNA的提取

將實驗室保存的不同物種肉粉各取50 mg，分別置于1.5 mL離心管中，按照食品基因組DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA，最終以100 μL ddHO溶解基因組DNA。使用超微量分光光度計測定DNA質量濃度，再分別稀釋至1.0×10pg/μL，置于-20 ℃貯存，備用。

1.3.3 實時熒光PCR方法的建立及優化

月季(Rosa chinensis Jacq.)是薔薇科薔薇屬植物，原產于我國，在我國有 2000 多年的栽培歷史[1]。由于其極強的觀賞性和適應性，廣泛應用于園林綠化中，成為我國北方城市北京、天津等多個城市市花，建立了多處月季品種齊全、集中的專類公園。

瑪麗的困境可以理解為生活困境和心理困境。瑪麗的丈夫迪克經營著一個農場，由于迪克自身的經營理念，農場相當的不景氣，生活水平受到威脅，瑪麗整日只能待在破舊的鐵皮屋里，異常窘迫。與此同時，瑪麗的心理也在遭受著折磨，在殖民主義的環境下秉承著白人和黑人有別的觀念，跟土人摩西產生了曖昧關系......筆者將從“自我”、“本我”和“超我”的角度分析造成瑪麗困境的原因。

以雞、鴨、豬、牛、狐貍、水貂、驢、羊、鵝、馬基因組DNA為模板，無菌水為空白對照，分別按照1.3.3節優化后的最佳反應體系和反應條件，對雞、鴨、豬和牛源性成分實時熒光PCR方法的特異性進行分析。

1.3.5 實時熒光PCR方法的靈敏性實驗

1.3.4 實時熒光PCR方法的特異性實驗

1.3.6 市售速凍食品檢測

將1.0×10pg/μL的雞、鴨、豬、牛基因組DNA按照10 倍梯度稀釋的方法依次稀釋至1.0×10pg/μL，取1 μL為模板進行實時熒光PCR檢測，通過熒光信號的有無和擴增曲線的趨勢，對所建立方法的靈敏性進行評價。

數據庫系統是大數據背景下數據庫技術中的“基礎篇”，因此，高等院校應當增加對數據庫系統講授經典的關系數據模型及相應的數據管理技術的課時，將其作為必修課程，每周必須要安排3個課時。經典數據庫技術主要包括數據庫學科中重要和通用的基礎理論和思路。課程重點應當包括關系數據模型、數據庫邏輯設計、ER模型、查詢優化、數據庫表設計和事務管理等。同時還要簡單地介紹關系代數、函數依賴、規范化的基本理念和思想及SQL語句、視圖、存儲過程、觸發器等基本思想。這些理論知識在學期末采取閉卷考試的方式對學生的掌握情況進行考核。

不對！他突然覺得似乎哪里有些不對勁，于是再次望向了那尊白玉骸骨，這才發現，骸骨原先那種白玉般的光澤已然不見，干巴巴的，像從土里剛剛挖出來一樣。

1.4 數據處理

使用ABI 7500實時熒光PCR儀系統分析軟件（v1.5.1）對檢測結果進行分析，獲得樣品Ct值；再利用Excel軟件對平行實驗測定結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR方法的建立及優化

以雞、鴨、豬和牛基因組DNA為模板，根據Ct值、熒光強度和擴增效率確定實時熒光PCR方法最佳的反應體系和反應條件。結果表明，實時熒光PCR方法同時檢測雞、鴨、豬和牛源性成分的最佳反應體系為：2×探針法熒光PCR預混液12.5 μL，上、下游引物終濃度均為400 nmol/L，探針終濃度400 nmol/L，模板DNA 1 μL，無菌水8.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸35 s，40 個循環，在退火延伸時采集熒光信號。

分別以提取的雞、鴨、豬、牛基因組DNA作為模板，采用矩陣實驗分別對引物和探針的濃度及退火溫度進行優化。反應體系為25 μL：2×探針法熒光PCR預混液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）終濃度分別為160、240、320、400、600 nmol/L，探針（10 μmol/L）終濃度分別為240、320、400、600 nmol/L，模板DNA 1 μL，再用ddHO補足至25 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，退火溫度分別設置為55、58、60、63 ℃，退火延伸35 s，40 個循環，在退火延伸時采集熒光信號。在其他條件相同的情況下，以雞、鴨、豬和牛源性成分實時熒光PCR方法中，循環閾（cycle threshold，Ct）值最低、熒光信號最強且擴增效率最高的組合為最佳的引物、探針濃度和反應條件。

2.2 特異性實驗結果

由圖1可知，空白對照組未出現擴增，說明反應體系未受污染，只有雞、鴨、豬和牛源性成分出現特異性擴增曲線，其他物種均未擴增，表明雞、鴨、豬和牛源性成分的實時熒光PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖1 雞、鴨、豬、牛源性成分實時熒光PCR方法特異性實驗結果Fig. 1 Specificity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.3 靈敏性實驗結果

將1.0×10～1.0×10pg/μL的雞、鴨、豬、牛基因組DNA作為模板，進行實時熒光PCR方法檢測。由圖2可知，當雞、豬、牛基因組DNA質量濃度為10.0 pg/μL、鴨基因組DNA質量濃度為1.0 pg/μL時，實時熒光PCR方法仍出現典型擴增曲線。表明本研究所建立的同時檢測雞、鴨、豬、牛源性成分實時熒光PCR方法的靈敏性分別為10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL。

圖2 雞、鴨、豬、牛源性成分實時熒光PCR方法靈敏性實驗結果Fig. 2 Sensitivity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.4 市售速凍食品的檢測結果

使用建立的實時熒光PCR檢測方法，對34 份速凍食品同時進行雞、鴨、豬、牛源性成分檢測，并將檢出的成分與食品外包裝上標識的成分進行對比分析。結果表明，所建立的方法能夠實現對34 份樣品中4 種動物源性成分的有效檢測，進一步分析表明，有15 份速凍食品檢出的動物源性成分與食品外包裝上標注的成分不一致，其中12 份未標注雞肉成分的速凍食品檢出雞源性成分，3 份未標注鴨肉成分的速凍食品檢出鴨源性成分，1 份未標注牛肉成分的速凍食品檢出牛源性成分（表2）。

表2 市售速凍食品動物源性成分檢測結果Table 2 Results of real-time PCR for animal-derived ingredients in quick-frozen food

3 討 論

肉類摻假現象的存在不利于市場環境的公平、健康發展，涉及摻假售假的肉制品也將損害消費者的合法權益。眾所周知，有宗教信仰人士和健身愛好者因自身需求會對牛肉、豬肉和雞肉等肉制品進行嚴格的選擇；過敏體質和疾病患者等特殊人群也需明確產品成分來規避誤食風險。因此，對肉制品進行動物源性成分鑒定意義重大，已被列入我國食品安全風險的常規監測計劃。

高溫、復雜的加工方式會造成源性成分DNA碎片化，從而降低檢出率，導致誤判，故現有大量肉源性成分檢測方法主要針對熱加工肉制品。然而，隨著人們生活節奏的改變，速凍食品在肉類市場中的占比逐漸增大；且已有研究表明，長時間的冷凍保存也會導致源性成分DNA降解，因此針對速凍食品檢測方法的研究至關重要。目前針對速凍食品中動物源性成分檢測的報道較少，因此，本研究建立了一種可以同時對速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分進行檢測的實時熒光PCR方法。

在動物源性成分的檢測方法中，基于DNA擴增的分子生物學方法種類繁多且各有優勢，然而實際檢測工作中更需要一種簡單、準確、經濟、省時的方法。實時熒光PCR技術成本低，能在DNA部分降解的情況下獲得足以進行擴增的片段基因，檢測快速，因此被廣泛應用于肉制品中動物源性成分的鑒定。本研究基于實時熒光PCR技術建立的同時檢測雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測方法，操作簡單、檢測時間較短，與常規的單一源性成分實時熒光PCR檢測方法相比，檢測時間從4 h減少到1 h，大大縮短了檢測周期；使用異源性DNA來驗證各對引物和相應探針的特異性，結果表明，本研究建立的雞、鴨、豬和牛源性成分檢測方法特異性強，能有效區分雞、鴨、豬、牛和其他動物源性成分；對雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測靈敏性可分別達到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL，靈敏性良好。René等建立的多重實時熒光PCR方法可檢測到100.0 pg/μL的豬和牛源性DNA；Cheng Xin等建立的同時檢測雞、鴨、豬成分的多重實時熒光PCR方法，對每種目標源性DNA的靈敏性為150.0 pg/μL，上述研究中檢測方法的靈敏性均低于本研究。

根據石家莊市內不同農貿市場和超市速凍食品的銷售情況，本研究選擇涵蓋市面上主要速凍食品品牌和種類的34 份樣品，包括速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等。應用本研究建立的方法對市售34 份速凍食品進行雞、鴨、豬和牛源性成分檢測，結果表明，該方法能夠實現對不同種類速凍食品中4 種肉類成分的有效檢測，進一步分析發現，其中15 份速凍食品中檢出的動物源性成分與食品外包裝上標注的成分不一致，驗證了該方法的實際應用效果。但本研究在檢測過程中無法排除生產、貯藏、運輸和銷售等過程中樣品交叉污染或原料混入造成的“假陽性”結果，考慮到生產線同時生產含其他肉類的產品，無法準確判斷此次檢測樣品的情況屬于“無意沾染”還是“惡意摻假”。因此，后續將進行動物源性成分的定量分析，以進一步準確判斷。

踐行“雙重領導”。湖南電信紀委緊緊圍繞“查辦案件以上級紀委領導為主”這個核心，牢牢把握“線索處置和案件查辦在向同級黨委報告的同時必須向上級紀檢組報告”這個重點，每個季度向上級紀檢組和同級黨委匯報工作。

4 結 論

本研究以雞基因、豬基因和鴨、牛基因為靶基因建立了一種能夠同時檢測速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的實時熒光PCR方法，特異性強、靈敏性高，能夠應用于速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測。該方法操作簡單、適用范圍廣，檢測周期短，可為食品監管部門對速凍食品中肉類摻假檢測提供有力的技術支持。