磷脂酶A2對肉制品的影響研究進展

劉 裕，徐佳美，李金玲，李鵬鵬，馬晶晶，耿志明,*，王道營,*，徐為民

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

磷脂酶A（phospholipase A，PLA）是最早被人類鑒定和研究的生物酶之一，研究發現，PLA能特異性催化磷脂底物2位置酯鍵，釋放出游離脂肪酸和溶血磷脂，通過多種方式作用，如花生四烯酸進一步轉化為脂質信號介質，再經過多種不同下游酶的作用轉化為類二十碳烯酸。這些類二十碳烯酸分子可以發揮廣泛的生理和病理作用。PLA存在于幾乎所有類型的生物體中，在哺乳動物中，它們在大多數的細胞和組織中都普遍表達，在哺乳動物的生命過程中起著非常重要的作用，影響生物體的生長、發育和繁殖。

肉品中含有豐富的脂質和蛋白質，是人類攝取營養物質的重要來源。中國是肉品消費大國，在中國居民肉類總消費中，豬肉消費占據60%左右，處于主導地位，肉品的食用安全性是人們所關注的問題，提高肉品在貯藏、加工等過程中的品質是研究的重點方向。研究發現，肉品的脂質水解從動物屠宰后就開始進行，且受到溫度、氧氣等周邊環境因素的影響，生肉時期的脂質水解反應會嚴重影響肉類的品質和消費者的可接受性。因此，了解肉品脂質水解進程有助于提高肉品品質。

中國傳統肉制品的歷史十分悠久，并且種類繁多，其中的典型代表有火腿、臘肉、風干魚、風干雞、板鴨等。因其肉質緊實、風味獨特深受歡迎，研究發現，肉制品風味物質的形成是極其復雜的過程，加工過程中發生的脂質水解是風味物質形成的重要途經。適度的水解氧化有助于肉制品中風味物質的形成，但過度的水解氧化會產生一系列有害物質，如羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecaenoic acids，HODEs）、4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）等。由此可見，在腌臘肉制品加工過程中，控制肉制品中脂質的水解進程對于提高肉制品品質很有必要。

磷脂的水解發生在脂質-水界面，對于PLA的研究必須考慮實驗技術將如何在這種類型的細胞環境中操作（底物聚集、膜締合等），但現在的技術還不能夠提供PLA的完整特征，對PLA的研究多集中在活性和生理作用方面，目前關于PLA的概況及其對肉品加工、品質等方面影響的系統總結較少，本文從內源PLA的概況、提取純化及其在肉制品加工過程中的活性變化等方面進行綜述，旨在系統了解PLA，為進一步闡述PLA功效提供參考。

1 PLA2的概況

PLA是磷脂酶家族中的一員，具有特異性水解磷脂甘油分子上二位酰基（-2）生成溶血磷脂和游離脂肪酸的功能。根據其序列、分子質量、二硫鍵模式、對Ca需求的不同，把PLA劃分為4 種：分泌型PLA（sPLA）、胞漿型PLA（cPLA）、鈣非依賴型PLA（iPLA）和許多其他沒有分類但具有PLA活性的酶。

1.1 sPLA2

sPLA是一種從蛇毒、哺乳動物胰腺和哺乳動物細胞中鑒定和詳細研究的PLA，大多數sPLA對陰離子磷脂，如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）表現出較高的活性。根據sPLA二硫鍵模式、發現順序不同，對其進行編號和分組。其中，人類基因組包含9 種sPLA，小鼠基因組包含10 種，在哺乳動物、昆蟲、軟體動物、爬行動物、植物和細菌中鑒定出18 種形式的sPLA，如表1所示。該酶功能主要包括殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，從而影響宿主防御細菌感染的能力，調節高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平，并在動脈粥樣硬化等炎癥性疾病中發揮重要作用。

表1 部分sPLA2組成[18]Table 1 Composition of some sPLA2[18]

1.2 cPLA2

經過研究發現，cPLA在人體免疫系統中起到非常重要的作用且和多種疾病的形成有重要聯系，包括血栓的形成、癌癥、動脈粥樣硬化、哮喘、關節炎和鼻炎等。通過剖析其晶體結構，發現cPLA主要由C2結構域和催化結構域相連而成，二者的共同作用對cPLA活性至關重要。目前為止，研究者已從人、小鼠等生物體中分離鑒定出6 種cPLA，其特征總結如表2所示。研究表明，cPLA大多能被Ca激活，并確定了C2結構域是主要的結合位點，對水解磷脂具有促進作用。

表2 部分GIV組cPLA2組成[20]Table 2 Composition of some group GIV cPLA2[20]

1.3 iPLA2

iPLA已經被證實在細胞膜穩態和重塑中起到關鍵作用，它在人體組織中分布最廣，包含6 個不同成員：GVIA、GVIB、GVIC、GVID、GVIE和GVIF（表3）。ATP激活已被反復證明是iPLA活性的主要調節者，這種酶通常存在于線粒體中，線粒體中的ATP水平對細胞調節至關重要。iPLA是唯一被認為受ATP調節的PLA，并且與神經系統功能和功能性障礙密切相關，如神經傳遞和神經退行性變疾病等。

表3 部分iPLA2組成[2]Table 3 Composition of some iPLA2[2]

2 PLA2的提取、純化與活性測定

目前關于PLA的提取純化研究大多數集中在動物胰臟、肺及蛇毒等。PLA作用于磷脂，磷脂通常在水環境中聚集，形成膠束、囊泡、脂質體和其他大型結構聚集體，對于PLA的研究是一項具有挑戰的任務，通常PLA都是從動植物體內獲取，采用不同的提取純化方式獲得高活性PLA，并以此為基礎展開對其活性和理化性質的研究。

2.1 PLA2的提取、純化

郝彩等在廣東舟山眼鏡蛇的蛇毒中提取、純化PLA，采用化學沉淀、SephadexG-50凝膠過濾陽離子交換層析等方法，達到純化PLA的目的。付道瑩等從廣西眼睛蛇的蛇毒中提取PLA，采用CM-SepharoseCL-6B離子交換柱、SephadexG-50凝膠層析柱等相結合，對PLA進行分離純化，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）證實所得到的PLA純度大于90%。Souza等從天藍猿猴的皮膚分泌物中提取PLA，經過冷凍干燥、反相高效液相色譜法等操作，在216 nm及280 nm處手動收集所有步驟的PLA從而達到分離純化的目的。Teke等采用一種特別的純化方式，基于含有PE（PLA底物）的殼聚糖，嘗試開發一種大分子水溶性樹脂，結合超濾技術，從牛胰腺中純化PLA。一些經典技術，如高效液相色譜法、薄層色譜法、電泳法和超臨界流體萃取法等，雖然可以達到純化、分離的目的，但由于運行成本過于昂貴，并且都會使用對人體和環境有害的有機溶劑，所以不適合大規模生產純品PLA，且因為原材料來自自然界，導致提取率低下，成本昂貴，最終造成了純品PLA在市場上價格昂貴的局面。

隨著基因重組技術的發展，更多研究選擇異源可溶表達，通過將目的PLA基因導入原核細胞中，誘導其體外表達，通過分離、純化的手段，獲得活性強并且純度高的PLA。Karray等將雞心臟的PLA基因（ChPLA-V）插入到畢赤酵母細胞中，誘導表達，通過2 次色譜純化得到純化酶ChPLA-V，其具有明顯的抗炎、抗菌效果并且抗凝活性是從雞腸道和胰腺中提取的PLA的10 倍。馬文君等將人源PLA基因導入至載體pET28+上，并在大腸桿菌中誘導其表達，使用硫酸銨鹽析、Q柱純化、Amylose柱純化等技術，分離純化得到重組PLA，經過SDS-PAGE測定，純化過后的重組酶純度大于90%并且該酶具有較高的活性。王欽等采用鯉魚PLA的催化活性區基因導入至不同原核細胞表達，經過鎳柱純化測定其蛋白純度能達到95%、87%和47%，且有較強活性。通過異源可溶性表達獲得的PLA純度、活性都遠超從自然界提取的PLA，并且成本較低，是現在一項主流技術。采取不同的方式提取、純化PLA，其最終目的都是為得到純度高、活性強的PLA，并以此為基礎探究一系列生物酶活性、特定的功能效應，也為其接下來的推廣應用打下基礎。

2.2 PLA2活性的測定

PLA活性的測定是進行酶研究的基礎，由于PLA活性不能直接通過熒光、紫外等直接測定，但其能夠特異性水解磷脂-2位置，產生不飽和游離脂肪酸，常以此為基礎，間接測得PLA活性。

2.2.1 傳統比色法

傳統比色法是較早用于測定酶活性的方法，馮杰等根據和脂蛋白相關的PLA，將豆寇酰基-2-(4-對硝基苯酚丁二酸酐)作為反應底物，水解磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）-2位，獲得有色產物4-對硝基苯酚，4-對硝基苯酚在405 nm波長處會出現吸收峰，根據吸光度變化速率，可計算得出脂蛋白PLA的活性。Gao Jianfang等將大豆卵磷脂作為反應底物，通過PLA與大豆卵磷脂、酚紅混合均勻后，在室溫條件下靜置1 min，顏色由淺紫變為黃色的速率作為判斷PLA活性大小的依據。王欽等采用偶聯氧脂合酶法測定純化后的鯉魚PLA活性，以二亞油酰磷脂酰膽堿為PLA的反應底物，脂氧合酶作為偶聯酶，二亞油酸被PLA從底物中水解釋放，再被脂氧合酶氧化，產生過氧化氫，在234 nm波長處吸光度發生變化，間接得到水解生成二亞油酸的量，從而測得PLA的活性。但傳統比色法的缺點是耗時較長，靈敏度和選擇性不強。

2.2.2 熒光分析法

從20世紀90年代起，熒光分析法常被用于測定酶活性大小，其原理是使用特異性熒光基團標記底物作為探針，通過熒光的強弱變化測得酶活性。Malley等提出iPLAβ的晶體結構，該酶顯著修正了現有的力學模式，催化結構域形成緊密的二聚體，這些特征揭示了該酶細胞定位和活性調節機制，通過將PLA放入Pyrene-PC中，在激發光波長340 nm的條件下連續測定熒光值的變化，從而測定該酶的活性大小，相比于傳統比色法，熒光分析法是一種更為強大的分析手段，具有耗時短、分析量少、靈敏度高等優點。

2.2.3 液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析法

伴隨著高效液相色譜的普遍應用，直接測定PLA水解磷脂產生的亞油酸（linoleic acid，LA）含量，被認為是最直觀反映PLA活性的方法。Balakrishna等以1-棕櫚酰-2-月桂酰--甘油-3-磷酸膽堿為反應底物，采用LC-MS法測定PLA水解產生LA的含量，從而直接測得其活性。目前普遍認為，高效液相色譜法測定PLA活性，其測定效率、靈敏度等均遠超熒光分析法，但也存在操作復雜、成本高等問題。

3 PLA2在生肉水解、氧化中的作用

生肉的脂肪組織和肌肉組織是脂肪酸的主要存在組織，后者除了含有中性脂肪外，超過50%都是以富含多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）磷脂的形式存在。脂質水解的過程就是將脂質分子分解成甘油和脂肪酸的過程，這其中PLA有重要作用，它能特異性水解磷脂-2位上的脂肪酸，生成不飽和游離脂肪酸等水解產物，以甘油磷脂為例，經過PLA的水解作用，生成-2酰基溶血性磷脂和不飽和游離脂肪酸，如圖1所示。

圖1 甘油主鏈的sn-2位置由PLA2催化的特定反應Fig. 1 Specific reactions catalyzed by PLA2 at the sn-2 position of the glycerol backbone

生肉在冷藏和冷凍期間一直發生脂質水解、氧化，二者之間的關系很復雜，直接或間接影響生肉的貯藏、運輸等。Chen Tao等通過測定豬肉冷凍貯藏48 h后的滴水損失，發現其變化與肌肉中的PLA呈正相關，由此推測生肉發生水解反應與生物膜喪失作為半透性屏障的能力導致水解酶外泄有關。袁璐等研究冷鮮肉在真空包裝和高氧氣調包裝（80%氧氣+20%二氧化碳）條件下的保水性變化，發現無論使用哪種包裝方式，在冷鮮肉冷藏期間PLA的活性都有上升趨勢，脂質氧化進程也逐步加快。在家禽生肉中，常出現的PSE（pale, soft,exudative）肉的形成和PLA有著密切關系，其特點為pH值迅速升高、持水力下降、顏色改變。de Avila Souza等發現暴露在熱應激條件下，具有PSE特征雞肉的PLA活性是非熱應激條件下的1.25 倍，PSE雞肉的脂質氧化與PLA呈正相關，即PLA具有促進氧化的功能，從而影響雞肉的品質。脂質的水解與氧化是密不可分的，二者相互影響，共同作用于生肉，PLA又是其中重要的內源酶，因此了解其在水解、氧化中的作用，對于提高生肉品質有重要作用。

PLA能夠促進生肉的水解進程，在氧化進程中也會起到一定程度的抑制作用。Zhang Muhan等利用等壓標簽進行蛋白質組學分析，發現冷藏3 d后，丙二醛含量較低的鴨胸脯細胞溶質PLA的表達水平較高，這意味著該酶具有抗氧化作用。Lee等研究PLA對鱈魚肌肉脂質氧化的抗氧化作用，發現PLA不僅抑制初級和次級脂質氧化產物的形成，而且延緩血紅素蛋白的氧化。此外，鐵酰血紅蛋白的形成是一種高價氧化形式的血紅蛋白，被發現與鱒魚血紅蛋白的氧化作用有關，隨著研究的深入，發現鈣離子的有效性和pH值是控制PLA對生肉脂質氧化的水解活性和抗氧化作用的重要因素。

PLA是一種依附于細胞膜上可水解磷脂的酶，因此對其進行研究從一定層面上對于調控脂質水解、氧化進程，延長生肉的貨架期，提高其品質十分有益。

4 PLA2對肉制品品質的作用及其影響因素

4.1 肉制品風味形成機理

風味是肉制品最重要的特征之一，強烈影響消費者的購買欲望。風味物質包括滋味呈味物質和揮發性風味化合物。脂質是肉品的重要組成成分，主要包括皮下脂肪和肌內脂肪。在肉制品加工中，脂質（甘油三酯和磷脂）降解為游離脂肪酸主要與內源和外源性脂肪分解酶的活性有關。研究表明，肉制品加工過程中，磷脂在內源PLA等的作用下，游離態PUFA先被水解，再被氧化產生一系列醛、酮、醇等氧化產物，進一步分解形成小分子物質，參與風味的形成；適度的水解氧化有助于肉制品中風味物質的形成，但過度的水解氧化會產生一系列有害物質，如HODEs、4-HNE等，這些過程決定了產品的風味特征，并取決于幾個因素之間的復雜相互作用。

肌內磷脂是影響肉制品風味和營養的主要因素，其包含PC、PE、磷脂酰肌醇、PS等，其中PC占肌內磷脂的45%～60%。徐為民等提出，在腌臘肉制品中，肌內磷脂是風味物質形成的重要前體物質，因為降解酶的作用，在肉制品的加工過程中游離脂肪酸含量升高。水解反應一直伴隨著整個腌制過程，并且可以進一步被反應分解生成小分子風味物質。能夠水解磷脂的酶統稱為磷脂酶，PLA是其中重要的內源酶。在PLA的作用下，磷脂水解產生大量游離態PUFA。與磷脂-2位上結合態的PUFA相比，游離態的PUFA更容易氧化，產生一系列風味物質或風味物質前體。PLA參與的磷脂水解對腌臘肉制品的風味、品質具有重要影響，并且腌臘肉加工程序的不同對PLA的活性也有著不同程度的影響。

4.2 PLA2對肉制品品質的影響

肉制品的品質與其風味存在重要聯系，通常評價腌臘肉品質時，風味是一項重要的指標。由前論述可知，風味物質的形成和脂肪水解有著密不可分的聯系。Waraho等通過測定干腌鴨肉加工過程中PLA和磷脂酶C活性、中性脂質、游離脂肪酸和磷脂含量的變化觀察到，花生四烯酸相對含量顯著下降（＜0.05），同時游離脂肪酸含量顯著增加（＜0.05），這進一步證實在傳統的中國干腌鴨加工過程中，磷脂被PLA水解，產生風味物質的前體物質，進而進一步被下游酶分解產生小分子風味物質，影響干腌鴨的品質。Merlo等進行臘肉貯藏期間感官特性的研究，鑒定出的69 種揮發性有機化合物，如醛類、醇類、酮類和酸類等都與PLA的水解有密不可分的聯系。Huang Yechuan等測定中國傳統臘肉加工過程中的理化指標、磷脂酶和脂肪氧合酶活性等，發現中國傳統臘肉加工過程中，肌肉內脂質中的三酰甘油和磷脂都是優先分解脂肪，脂肪分解過程是獨立的，其中磷脂是游離脂肪酸的主要來源，此外，臘肉中脂質過氧化物的形成更多地與磷脂水解有關。磷脂水解在一定層面影響了脂質氧化和風味物質的形成，提升了臘肉的品質。PLA影響腌臘肉的品質主要通過影響磷脂的水解、氧化過程，促使形成小分子風味物質，從而使腌臘肉具有不同風味，影響腌臘肉最終品質。

近年來研究發現，卵磷脂氫過氧化物是腌臘肉制品中油脂氧化的主要組分，動物肌肉PLA具有水解卵磷脂氫過氧化物、形成HODEs前體的活性，推測出腌臘肉制品加工過程中存在基于PLA水解磷脂氫過氧化物的磷脂降解途徑，影響了腌臘肉的最終品質，目前還沒有明確的研究闡述這條完整的途徑，這將會成為未來研究的重點方向。

4.3 不同加工工藝對PLA2活性的影響

內源PLA在水-脂界面水解磷脂-2位上的PUFA，殘存酶活力與加工條件（水分活度、溫度、鹽分等）密切相關。Zhou Guanghong等指出，脂肪酶、酯酶和磷脂酶是肌內磷脂水解的重要內源酶，經測定在金華火腿的腌制干燥成熟過程中磷脂酶的活性僅保留了初始活性的7.56%。Jin Guofeng等發現，在培根腌制和干燥-成熟的過程中磷脂酶的活性保留了初始活性的9.1%，干腌制品的內部水分活度、鹽分等是影響酶活性的重要因素。Waraho等在干腌鴨的加工過程中觀察到磷脂存在降解，PLA活性隨著處理時間的延長而降低，干燥結束時保留了初始活性的83.70%，在整個過程中，游離脂肪酸和中性脂質的PUFA含量逐漸增加，而磷脂的PUFA逐漸減少，PLA的相對活性與磷脂含量的下降和游離脂肪酸含量的增加存在顯著相關性，PLA在肌內磷脂降解中起到重要作用。由此可見，加工程序會影響肉制品中PLA的活性，從而影響脂肪分解，說明腌制方法、水分活度、pH值、鹽分、溫度等影響酶活性，從而影響對腌臘肉加工工藝的選擇。在臘肉等加工過程中，低鹽、高水分將會促進酶活性，但經過高溫處理，臘肉制品的水分流失嚴重，細胞結構被破壞，細胞質被不斷濃縮，導致PLA活性降低。眾多研究結果表明，PLA的活性變化受加工過程中眾多因素的影響，如原材料的種類、被處理的部位、加工工藝的選擇和微生物等。

5 結 語

本文闡述了4 種PLA對生物體的不同影響，提取、測定PLA的不同方式以及PLA在生肉、腌臘肉中的不同變化和影響因素。肉品的加工貯藏過程中始終伴隨脂質的水解，影響其品質。適度的水解可以促進肉品的風味形成，PLA在脂質水解過程中具有重要作用，因此了解PLA在肉品中的作用機理和外界因素對其的影響作用，將有助于提高肉品品質，但目前對于肉品中PLA研究較少且不深入，尚需要更多研究來證實PLA與肉品品質之間的相關性，PLA或將成為影響肉品品質的重要因子。