基于響應面法優化橄欖多酚提取工藝

吳曉青，孫燕麗，鐘碧萍，王倩雯

（福建生物工程職業技術學院，福建 福州 350007）

橄欖（Canarium albumRaeusch.）為橄欖科橄欖屬喬木植物的果實，呈青色、卵圓形，所以也稱為青果，藥食同源，橄欖富含蛋白質、脂肪、碳水化合物維生素C等［1］。研究表明橄欖中所含的最重要的功效成分為多酚類化合物，如沒食子酸、并沒食子酸、短葉蘇木酚等，具有增強免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌、消炎鎮痛、解酒護肝、抑制血糖升高、增加骨密度和骨鈣含量、抗乙肝病毒等作用［2-6］。目前，常用的植物中多酚的提取方法有熱回流法、浸提法、超聲提取法等，其中超聲提取法是應用超聲波強化提取植物的有效成分，當超聲強度達到一定程度時，能夠破壞植物細胞壁結構，使其瞬間破裂，細胞內的有效成分得以釋放，直接進入溶劑從而提高提取率［7］；且超聲提取法操作簡單，提取效率高，可以采用不同溶劑以滿足不同目標物提取的需要，尤其可以在低溫下操作，非常適宜于熱敏性物質的提取［8］。故本試驗選用超聲提取法提取橄欖多酚，通過單因素試驗結合響應面法，優化橄欖多酚的最佳提取工藝，為推動橄欖多酚的大規模生產和功能產品的開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800PC DS2型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-600GKDV型高功率恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHA-B恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；DS-1高速組織搗碎機（上海精科實業有限公司）。

1.2 試藥 橄欖購自福建閩清，經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定為橄欖科植物橄欖（Canarium albumRaeusch.）的果實；沒食子酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20851，純度≥98%）；碳酸鈉、福林酚試劑、無水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 橄欖多酚提取液的制備 取橄欖鮮果，洗凈，去核，60℃熱風干燥至恒重，粉碎，過40目篩，即得橄欖粉。精密稱取橄欖粉1 g，加入一定濃度的乙醇溶液，置于超聲波處理裝置中，調節功率為600 W，按照“2.3”和“2.4”項下的要求提取，過濾，濾液用適量蒸餾水稀釋，備用。

2.2 橄欖多酚得率的測定 采用課題組前期優化的橄欖多酚福林酚比色法測定橄欖多酚得率［9］。精確稱取沒食子酸對照品適量，蒸餾水稀釋制成25μg/mL沒食子酸對照品溶液。分別精密量取沒食子酸對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，稀釋后的橄欖多酚提取液1.0 mL，置刻度離心管中，加福林酚試劑3.0 mL，10%Na2CO3溶液4.0 mL，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在40℃恒溫水浴中反應45 min后，在765 nm波長條件下測定吸光度。以吸光度值Y為縱坐標，沒食子酸質量濃度X（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為Y＝1.32×10-1X＋7.21×10-3，r＝0.999 8，沒食子酸在1.008 0～5.040 0μg/mL范圍內具有良好的線性關系。根據標準曲線計算以沒食子酸為當量的橄欖多酚質量濃度，并按下列公式計算橄欖多酚得率：

式中：C為回歸方程計算出的質量濃度（單位：μg/mL）；m為樣品質量（單位：g）；V為測定時反應體系總體積（單位：mL）；N為稀釋倍數。

2.3 單因素試驗及結果分析

2.3.1 乙醇濃度對橄欖多酚得率的影響 甲醇、乙醇、丙酮、水均為植物多酚的常用提取溶劑，當樣品為固體時，純的有機溶劑不足以破壞樣品中多酚類物質與蛋白質或其他物質的連接，多酚的提取率低，但當提取劑中水的比例過高時，糖等水溶性雜質的浸出率也較高。不同極性溶劑對多酚物質的提取效果有顯著的影響，故本試驗選用安全性更高的乙醇作為有機溶劑，與水混合成適當極性的溶液作為橄欖多酚提取的溶劑。在液料比為30 mL/g、超聲時間為30 min、超聲溫度為40℃的條件下，分別考察乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%時的橄欖多酚得率，結果見圖1。圖1顯示：橄欖多酚得率隨著乙醇濃度的上升，呈現先上升后下降趨勢，當乙醇濃度為50%時，橄欖多酚得率達到最大值。故50%乙醇溶液提取橄欖多酚較佳。

圖1 乙醇濃度對橄欖多酚得率的影響

2.3.2 液料比對橄欖多酚得率的影響 原料和溶劑接觸面積與液料比有關，影響橄欖多酚的提取效果。以50%乙醇溶液為提取溶劑，在超聲時間為30 min、超聲溫度為40℃的條件下，分別考察液料比為10、20、30、40、50 mL/g時的橄欖多酚得率。結果見圖2。圖2顯示：隨著液料比提高，橄欖多酚得率呈現先上升后下降的趨勢，當液料比達到30 mL/g時，橄欖多酚得率達最大值。故液料比為30 mL/g時提取橄欖多酚較佳。

圖2 液料比對橄欖多酚得率的影響

2.3.3 超聲時間對橄欖多酚得率的影響 在一定時間范圍內，延長提取時間可以增加多酚的溶出量，但當提取時間繼續延長時，多酚已基本溶出或溶劑對物料的作用達到某種平衡，并且時間過長會破壞多酚的化學結構，影響多酚的提取效果。以50%乙醇溶液為提取溶劑，在液料比為30 mL/g、超聲溫度為40℃的條件下，分別考察超聲時間為10、20、30、40、50 min時的橄欖多酚得率，結果見圖3。圖3顯示：隨著提取時間的延長，橄欖多酚的提取率先上升后下降，當超聲時間為30 min時，橄欖多酚得率達到最大值。隨著提取時間的繼續延長，橄欖多酚的得率反而下降。故超聲時間為30 min時提取橄欖多酚較佳。

圖3 超聲時間對橄欖多酚得率的影響

2.3.4 超聲溫度對橄欖多酚得率的影響 由于溫度升高，細胞壁滲透性增強，胞內物質更易溶出，但超聲溫度過高時，多酚類物質結構被破壞、降解。以50%乙醇溶液為提取溶劑，在液料比為30 mL/g、超聲時間為30 min的條件下，分別考察超聲溫度為30、40、50、60、70℃時的橄欖多酚得率，結果見圖4。圖4顯示：隨著超聲溫度的不斷上升，橄欖多酚提取率先上升后下降。故超聲提取溫度50℃較適宜。

圖4 超聲溫度對橄欖多酚得率的影響

2.4 響應面法試驗及結果分析

2.4.1 響應面法試驗 為進一步研究變量之間交互作用的影響關系，使用響應面法優化橄欖多酚提取的最佳工藝。根據Box-Behnken中心組合設計原理，在單因素試驗基礎上，以多酚得率（Y）為響應值，以影響提取的主要因素乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）為影響因素，設計四因素三水平響應面法試驗。響應面因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素與水平設計

2.4.2 統計分析和模型擬合 采用Design-Expert 10.0.1軟件設計試驗樣本共計29個，其中中心組5個，響應面法試驗設計及結果見表2。通過數據分析得到回歸擬合方程為：Y＝6.956＋0.297 5A＋0.170 833B-0.002 5C－0.042 5D－0.032 5AB－0.042 5AC＋0.052 5AD－0.082 5BC＋0.032 5BD＋0.022 5CD－0.4234 17A2－0.358 417B2－0.480 917C2－0.465 917D2。

表2 響應面法試驗設計及結果

對橄欖多酚得率預測數學模型進行方差統計分析，F值越大，表明有關模型分量對響應影響貢獻度越高；當顯著性檢驗概率P＜0.05時，表明該變量對響應值影響顯著，當P＜0.01時，表明該變量對響應值影響非常顯著。由表3可知，按影響橄欖多酚得率貢獻大小排序為：A＞B＞D＞C，即乙醇濃度＞液料比＞超聲溫度＞超聲時間。模型的決定系數（R2）為0.977 3，說明模型擬合優度較高，且調整后的決定系數（R2adj）＝0.954 5，能夠解釋實驗95.45%的響應值變化，并與預測相關系數（R2pred）相差不大，表明該模型具備較高預測精準度。綜上，上述模型可用于分析和預測橄欖多酚的最優得率。

表3 響應面試驗方差分析

2.4.3 響應面分析 兩兩因素交互作用對橄欖多酚提取得率的影響見圖5～圖10。從圖5可見，乙醇濃度和液料比的交互作用對橄欖多酚得率的影響呈拋物面分布，當乙醇濃度一定時，隨著液料比的增加，橄欖多酚得率先上升后小幅下降；當液料比不變時，隨著乙醇濃度的提高，橄欖多酚得率也呈現先增加后小幅減小。僅考慮二者因素作用下的最優組合為乙醇濃度50%～60%，液料比30～35 mL/g。圖6所示，乙醇濃度方向曲面波動幅度較大，表明該因素對橄欖多酚得率的影響較超聲時間影響顯著。橄欖多酚得率隨隨乙醇濃度和超聲時間的增加均呈現先增加后下小幅下降變化。故取乙醇濃度為50%～60%、超聲時間為25～35 min水平區間時橄欖多酚的得率最高。由圖7可見，橄欖多酚得率隨乙醇濃度和超聲溫度的增加呈先增后減變化，且在乙醇濃度方向的影響較大，乙醇濃度是橄欖多酚得率的敏感影響因子。當乙醇濃度為50%～60%，超聲溫度為45～55℃時，橄欖多酚得率較高。由圖8可知，液料比和超聲時間的交互作用等高線呈現顯著橢圓形，表明二者交互作用對橄欖多酚得率影響顯著。橄欖多酚得率隨液料比和超聲時間的增加呈先增后減變化。當液料比為30～35 mL/g，超聲時間為25～35 min水平區間時，橄欖多酚得率較高。由圖9可見，橄欖多酚得率隨液料比和超聲溫度的增加呈先增后減變化。液料比為30～35 mL/g，超聲溫度為45～55℃水平區間時，可顯著提高橄欖多酚得率。由圖10可知，橄欖多酚得率隨超聲時間、超聲溫度添加量的增加呈先小幅增后減小變化。當超聲時間為25～35 min，超聲溫度為45～55℃水平區間時，可提高橄欖多酚得率。

圖5 乙醇濃度-液料比的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

圖6 乙醇濃度-超聲時間的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

圖7 乙醇濃度-超聲溫度的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

圖8 液料比-超聲時間的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

圖9 液料比-超聲溫度的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

圖10 超聲時間-超聲溫度的交互作用對橄欖多酚得率影響的響應面及等高線圖

2.4.4 最優工藝條件的確定 為進一步準確確定最佳提取工藝，以橄欖多酚得率最大為優化目標，根據Design-Expert 10.0.1軟件運行結果，在乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度的共同影響下，橄欖多酚的最優提取工藝為：乙醇濃度為53.43%，液料比為32.267mL/g，超聲時間為29.621 min，超聲溫度為49.804℃，制備提取液。在此條件下模型預測的多酚得率為7.03%。

根據軟件預測結果，結合實際工藝設置的可行性，確定橄欖多酚最佳提取工藝為：乙醇濃度為53%，液料比為32 mL/g，超聲時間為30min，超聲溫度為50℃，在此條件進行3次平行驗證試驗，得橄欖多酚平均得率為7.01%，與模型預測結果接近，無統計學意義（P＞0.05），說明基于該響應面模型設計優化橄欖多酚提取的方法有效可行。

2.5 提取工藝驗證 分別取橄欖粉10 g，按“2.4.4”項下橄欖多酚最佳提取工藝，提取制備3批提取液，分別測定橄欖多酚得率，實驗結果提示經優化的橄欖多酚最佳提取工藝穩定可行。結果見表4。

表4 橄欖多酚提取工藝驗證試驗結果（n＝3）

3 討 論

相對于正交實驗的孤立試驗點分析，通過響應面法試驗，可以得到一個曲面型的分析模型，即連續的預測模型，因此在響應面法的優化過程中，能夠對各個水平進行連續分析。相對于平均設計來說，響應面法的實驗組合，能夠通過更少的試驗次數、更短的試驗周期，獲得更為準確的實驗結果。故本試驗在預實驗基礎上，選擇采用響應面法優化超聲提取法提取橄欖多酚的工藝。

實驗通過單因素試驗結合響應面法試驗，考察乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度等工藝條件對橄欖多酚提取得率的影響。通過單因素試驗發現各主要影響因素在一定范圍內均呈現先增加后減少的趨勢，故再運用響應面優化設計實驗，獲得了超聲提取法提取橄欖中橄欖多酚的最佳提取工藝為：乙醇濃度53%，液料比32mL/g，超聲提取時間為30min，超聲溫度為50℃。在此條件下橄欖多酚的得率為7.01%，與預測值7.03%基本一致。本研究結果可為橄欖多酚擴大規模的提取制備及功能產品的開發應用奠定基礎。