陽虛寒凝型兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立初探

桂 苗，施珊妮，黃澤靈，何俊君，李田花，洪振強，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學雜志社，福建 福州 350122；3.中醫(yī)骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122；）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性病變，臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫大、僵硬伴關(guān)節(jié)功能障礙等癥狀為主要表現(xiàn)，所引起的活動障礙和長期慢性疼痛嚴重降低患者的生活質(zhì)量［1］?！吨嗅t(yī)病證診斷療效標準》［2］將KOA分為腎虛髓虧、陽虛寒凝、瘀血阻滯3個證型，其中陽虛寒凝型是臨床常見的證型［3-4］。故本實驗采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶、薄荷油灌胃聯(lián)合恒溫恒濕培養(yǎng)箱建立兔陽虛寒凝型KOA模型，并進行中醫(yī)證型探討，為KOA中醫(yī)證候病理研究建立動物模型提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4月齡健康新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：［SCXK（滬）2017-0008］，委托福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心代購并飼養(yǎng)，動物使用許可證號：［SYXK（閩）2020-0003］。實驗前均適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物與試劑 薄荷油（上海源葉生物科技有限公司，批號：S24778）；木瓜蛋白酶（美國Sigma公司，批號：P8150）；蘇木精-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120-3）；白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號：MM-030501、MM-024001）。

1.3 實驗試劑及儀器 自動脫水機、組織包埋機、光學顯微鏡均購自德國Leica公司；酶標儀（芬蘭Thermo公司）；肛溫計（深圳市米樂儀器有限公司）；脈搏血氧儀（上海市貝瑞電子科技有限公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將24只4月齡新西蘭大白兔按隨機數(shù)字表法分為正常組、木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組，每組各6只。

2.2 模型建立 造模周期共4周。正常組不予干預，常規(guī)飼養(yǎng)；其余3組分別在第1周的第1、4、7 d采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL建立KOA模型［5-6］，造模前1 d，進行膝關(guān)節(jié)周圍備皮，造模時，消毒膝關(guān)節(jié)后注射木瓜蛋白酶溶液0.1 mL至關(guān)節(jié)腔，注射后再次消毒，用棉球壓住針眼，多次屈伸膝關(guān)節(jié)使木瓜蛋白酶溶液充分浸潤至整個膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)；陽虛寒凝組從第1周開始持續(xù)4周每日置于濕度為50%～60%、溫度為4～6℃、體積為1.2 m×1.2 m×1.8 m的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中不限活動1.5 h［7］，第3周予以0.65 mL/（kg·d）薄荷油連續(xù)灌胃2周建立陽虛寒凝模型［8-9］；陽虛組第3周開始予以0.65 mL/（kg·d）薄 荷 油 連續(xù) 灌 胃2周 建 立 陽 虛模型。

2.3 取材 造模結(jié)束后隔日取材，取材前12 h動物禁食不禁水，予3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。將麻醉后兔子仰臥固定于手術(shù)臺上，用手術(shù)刀沿膝關(guān)節(jié)正中線劃開皮膚，逐層分離肌肉，切斷髕韌帶，充分暴露膝關(guān)節(jié)囊后抽取關(guān)節(jié)液，將抽取的關(guān)節(jié)液迅速注入Ep管，并置于-80℃冰箱保存待測。取下膝關(guān)節(jié)滑膜組織和軟骨組織，滑膜組織用4%多聚甲醛固定后流水沖洗，常規(guī)包埋；軟骨組織用4%多聚甲醛固定后流水沖洗，常規(guī)脫鈣、包埋。

2.4 KOA模型檢測指標及方法

2.4.1 膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨病理形態(tài)學觀察 將包埋后的滑膜、軟骨組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后脫水、透明、固封，光鏡下觀察滑膜、軟骨組織的形態(tài)學改變。

2.4.2 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度評價 采用改良Mankin's評分法對KOA模型膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度進行評價［10］，主要評價軟骨組織的結(jié)構(gòu)、染色、潮線、細胞數(shù)量。分數(shù)越高，表示關(guān)節(jié)軟骨損傷越嚴重。

2.4.3 膝關(guān)節(jié)周徑測量和Lequesne MG評分 取材當天用皮尺測量4組兔膝關(guān)節(jié)周徑，觀察兔膝關(guān)節(jié)腫脹疼痛程度和屈伸功能，采用Lequesne MG評分［11］評估膝關(guān)節(jié)功能。

2.4.4 關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量檢測 取出凍存的關(guān)節(jié)液，采用ELISA法檢測關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量。

2.5 陽虛寒凝模型指標評定 測定兔體質(zhì)量、肛溫、心率及計算中醫(yī)證候評分。取材前稱取4組兔體質(zhì)量，采用肛溫計測量兔肛溫，采用脈搏血氧儀測量兔心率。參照《辨證論治實驗方法學：實驗小鼠診法與辨證》［12］，以表1、表2所列的癥狀及權(quán)重對陽虛癥狀和寒凝癥狀進行評分（權(quán)重=評分），評分由2名主治中醫(yī)師獨立評定，意見不一致時通過討論并與第3名主治中醫(yī)師商議決定。

表1 陽虛癥狀及權(quán)重

表2 寒凝癥狀及權(quán)重

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料符合正態(tài)性分布的以（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析中LSD-t法，方差不齊采用Games-Howell法。

3 結(jié) 果

3.1 4組膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)學比較 正常組軟骨組織切線層連續(xù)且完整，移行層中軟骨細胞縱向條索狀分布且排列規(guī)律，輻射層、鈣化層結(jié)構(gòu)完整，層次清晰；木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組軟骨組織表面不規(guī)整，纖維方向出現(xiàn)偏移、變薄，軟骨細胞排列紊亂。見圖1。

圖1 4組膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)學比較（HE染色，×50）

3.2 4組膝關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學比較 正常組滑膜表面平整，滑膜襯里細胞為一層，襯里下層細胞排列疏松，無纖維組織、血管增生，無炎性細胞浸潤；木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組滑膜表面不平整，滑膜襯里細胞層數(shù)增生明顯，襯里下層細胞排列紊亂，有纖維組織增生和炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 4組膝關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學比較（HE染色，×100）

3.3 4組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷改良Mankin's評分比較 正常組改良Mankin's評分為（0.33±0.21）分，木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組改良Mankin's評分分別為（8.17±0.31）、（7.33±0.21）、（7.00±0.26）分。與正常組比較，木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組改良Mankin's評分均顯著升高（P均＜0.05）。

3.4 4組膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較 見表3。

表3 4組兔膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

表3 4組兔膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與木瓜蛋白酶組比較，2）P＜0.05。

組別正常組木瓜蛋白酶組陽虛組陽虛寒凝組n6 6 6 6周徑/cm 11.217±0.221 12.508±0.1351）12.517±0.2671）12.508±0.1291）Lequesne MG評分/分0.500±0.224 4.667±0.2111）4.833±0.1671）5.333±0.2111）2）IL-1β/（ng/L）61.488±5.041 116.113±2.2661）110.067±3.2221）115.472±2.4321）TNF-α/（ng/L）48.115±4.430 115.173±3.0311）115.210±3.8591）116.225±3.4311）

3.5 4組陽虛寒凝模型指標比較 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評分比較見表4。

表4 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評分比較（±s）

表4 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評分比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與木瓜蛋白酶組比較，2）P＜0.05；與陽虛組比較，3）P＜0.05。

組別正常組木瓜蛋白酶組陽虛組陽虛寒凝組n6 6 6 6體質(zhì)量/kg 2.57±0.05 2.48±0.03 2.35±0.031）2）2.24±0.051）2）肛溫/℃38.633±0.088 38.783±0.101 37.817±0.2441）2）37.267±0.1171）2）心率/（次/min）232.500±6.318 251.333±5.880 207.500±6.9991）2）184.167±10.0881）2）3）中醫(yī)證候評分/分12.500±4.958 30.000±3.992 78.500±2.9971）2）109.833±5.2501）2）3）

4 討 論

4.1 中醫(yī)證候模型指標判定 參考《辨證論治實驗方法學：實驗小鼠診法與辨證》［12］建立動物模型中醫(yī)證候評價表，從中挑選出符合陽虛寒凝證的癥狀，將其分為陽虛和寒凝2類癥狀，2類中的相同癥狀，選取陽虛癥狀及權(quán)重表中權(quán)重進行計分。以蜷縮、精神萎靡、遲鈍、倦怠、呼吸減弱、軀體移動減弱、體溫降低等癥狀判定寒凝證；以唇、耳、毛淡，小便色淡，尾、爪涼，毛發(fā)稀少無光澤，心率減慢等癥狀判定陽虛證。

4.2 KOA模型判定 本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，木瓜蛋白酶組、陽虛組、陽虛寒凝組膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評分均升高，膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹、疼痛、屈伸功能障礙，關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量明顯升高，表明膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在炎癥；3組膝關(guān)節(jié)病理切片顯示滑膜有炎癥性改變，軟骨損傷明顯，改良Mankin's評分升高，提示膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨均有損傷［13］。這表明關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶能夠成功建立KOA模型。

4.3 陽虛寒凝證判定 本研究結(jié)果顯示：與正常組、木瓜蛋白酶組比較，陽虛組與陽虛寒凝組的陽虛寒凝癥狀評分顯著升高，體質(zhì)量、肛溫與心率顯著降低；與陽虛組比較，陽虛寒凝組體質(zhì)量、肛溫、心率降低更顯著。這表明陽虛寒凝組符合陽虛寒凝證候特征，陽虛寒凝模型建立成功。

4.4 不足之處分析 本研究探討陽虛寒凝的建立是通過中醫(yī)證候評分比較，探討中醫(yī)動物模型的建立。但表格中的癥狀難以全部依靠肉眼觀察，且僅憑肉眼觀察難以有科學精準的評價；權(quán)重和評分之間缺乏客觀的統(tǒng)一標準，而客觀的評價標準對于動物模型的計量化辨證具有重要的意義。在建立中醫(yī)證候評分表上，后續(xù)還需要查閱大量資料，結(jié)合人體臨床表現(xiàn)以及實驗動物特征，將中醫(yī)證候評分表進行細化，為后續(xù)中醫(yī)證候的動物模型建立提供量化的指標參考。