失重下柚皮苷作用于T細胞干預的成骨細胞增殖分化研究

周森 孫奇峰 蔣雷 張亞龍 楊宇恒 尹文哲

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科，黑龍江 哈爾濱 150001

長期失重環(huán)境導致機體出現骨量丟失問題，被認為是骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的誘導因素[1]，機體免疫機能的降低同樣困擾著人們進一步探索外太空。近年來，我國在中藥防護骨量丟失方面做了探索性研究，已嶄露頭角。已有研究[2]表明，中藥物質柚皮苷，可以增加骨量，促進骨折愈合。另外，柚皮苷對小鼠免疫能力有調節(jié)作用[3]。骨免疫學[4]指出，免疫反應同時影響著骨代謝，兩個系統(tǒng)之間存在相互作用。柚皮苷既調節(jié)骨代謝同時又具有調節(jié)免疫作用，而其中的免疫因子又參與骨代謝，那么，這兩者之間的共同細胞因子在骨代謝和免疫之間扮演何種角色？基于此，本研究擬對微重力下柚皮苷對T細胞干預下的成骨細胞增殖分化及其發(fā)生機制展開進一步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1實驗材料：選取出生24 h內的 SD 乳鼠(雌雄不限)10只，用于成骨細胞取材。實驗動物由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供。原代大鼠T淋巴細胞購于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司；低糖DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、II型膠原酶、青-鏈霉素 (Solarbio公司)；胎牛血清(四季青,浙江天杭生物科技股份有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；茜素紅S染色液(0.2 %, pH 8.3，北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒增強型(碧云天生物技術有限公司)；柚皮苷(成都植標化純生物技術有限公司)；Mouse Anti-GAPDH-Loading Control antibody、Mouse Anti-PCNA antibody、Mouse Anti-Erk2 antibody、 Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody(北京博奧森生物技術有限公司)；超敏ECL發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.1.2實驗儀器：主要儀器: 旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS，美國Equl 公司) ；CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus 公司)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿(美國corning公司) ；Olympus IX70 光學倒置顯微鏡[Olympus(奧林巴斯)中國分公司]；電泳儀、轉膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司) ；全自動數碼凝膠成像系統(tǒng) (上海天能科技有限公司，Tanon GIS2010) ；圖像分析軟件(德國 Leica 公司) ；酶標儀(奧地利，AUTHOS HT2) 。

1.2 方法

1.2.1成骨細胞培養(yǎng)：于75 %乙醇浸泡5 min后，在無菌條件下取得SD乳鼠頭蓋骨，仔細刮除表面結締組織，反復用PBS沖洗，洗去血絲。置于含雙抗的PBS培養(yǎng)皿中，用眼科剪將骨片剪成約1 mm3的組織塊。轉移至離心管中，1 200 r/min，離心5 min棄去雜質上清，加入2 mL無EDTA胰酶，37 ℃消化30 min，中間震蕩一次。棄上清，骨片中加入0.1 % II型膠原酶2 mL，37 ℃消化1.5 h，每隔約30 min震蕩一次，留取上清，1 000 r/min，離心10 min，重懸后接種。待貼壁細胞長至鋪滿瓶底80 %～90 %后，經胰蛋白酶消化，以1∶2比例傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。取處于對數生長期成骨細胞(第三代)，用于后續(xù)實驗。

1.2.2原代成骨細胞鑒定

1.2.2.1堿性磷酸酶活性化學染色：取處于對數生長期的第三代成骨細胞，以4 %多聚甲醛固定液固定30 min，按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進行染色檢測。

1.2.2.2鈣化結節(jié)染色(茜素紅法)：取處于對數生長期的第三代成骨細胞，棄去培養(yǎng)基，培養(yǎng)板用PBS沖洗3次，以4 %多聚甲醛固定液固定30 min，蒸餾水沖洗3次，37 ℃下0.2 %茜素紅[茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色30 min，蒸餾水沖洗。在低倍鏡視野(×40)下進行礦化結節(jié)觀察。

1.2.3柚皮苷溶液配制：稱量10 mg柚皮苷粉末，用0.085 mL DMSO溶液充分溶解后，用0.22 μm過濾器過濾除菌，即可配得濃度為0.2 mol/L的柚皮苷母液。通過完全培養(yǎng)基稀釋母液分別得到2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L 梯度濃度的干預液。所有干預液用0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4藥物濃度確定

1.2.4.1CCK-8 法檢測細胞增殖情況：取處于對數生長期的第三代成骨細胞，消化后重懸細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，以5×103個/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。分為干預組與對照組，干預組分別加入梯度濃度的柚皮苷干預液10 μL(終濃度分別為2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L)，對照組加入等劑量不含血清的培養(yǎng)基溶液。孵育24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內孵育1 h。酶標儀測定在450 nm處的吸光度，計算出細胞增值率。

1.2.4.2堿性磷酸酶活性測定和Western blot檢測：取生長狀態(tài)良好的第三代成骨細胞，接種置6孔板中，細胞生長至皿底的80 % ～ 90 %時，干預組分別加入梯度濃度的柚皮苷干預液(終濃度分別為2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L)，對照組加入等劑量不含血清的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取細胞總蛋白，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。應用ALP檢測試劑盒檢測各組ALP細胞活力。加入5×上樣緩沖液后沸水煮10 min，使用80 V恒壓待樣品進入分離膠后加壓至120 V恒壓電泳全程后轉膜，加入含5 %脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫封閉1 h。加入1∶1 000 稀釋的抗小鼠 PCNA(北京博奧森生物技術有限公司)，4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 清洗膜 3 次。加入 1∶10 000稀釋的羊抗鼠二抗孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，運用超敏ECL發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)檢測不同樣品蛋白表達。

1.2.5失重模型的建立:采用RCSS細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以30 r/min均勻培養(yǎng)48 h，期間隨時觀察細胞，若有氣泡產生應及時清除。將對照組置于培養(yǎng)瓶中，在正常重力下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.6成骨細胞與T淋巴細胞直接共培養(yǎng)

1.2.6.1分組：取生長狀態(tài)良好的第三代成骨細胞隨機分成正常重力不加藥組、正常重力加藥組、失重不加藥組、失重加藥組。待細胞鋪滿至瓶底，將T細胞以5×105個/mL濃度與其直接共培養(yǎng)。加藥組加入柚皮苷干預液。失重組置于回轉器內。

1.2.6.2ALP堿性磷酸酶活性測定：四組細胞培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，應用ALP檢測試劑盒檢測各組ALP細胞活力。

1.2.6.3Western blot檢測：失重組細胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗后，吸盡殘余液體，加入適量RIPA裂解液，用細胞刮刮下細胞后轉移至1.5 mL EP管中。按照說明書使用BCA試劑盒測量蛋白濃度，加上樣緩沖液，在100 ℃下變性處理蛋白10 min。制膠完成后，按總蛋白量20 μg上樣。使用80 V恒壓待樣品進入分離膠后加壓至120 V恒壓電泳至完成電泳，20 V半干轉轉膜20 min后，使用5 %脫脂奶粉封閉 1 h。然后敷目的一抗 ，4 ℃冰箱保存過夜，次日使用TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下二抗孵育2 h，再使用TBST洗膜3次，每次10 min ，顯影后采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析。每個實驗獨立重復 3 次。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t-test進行分析。以P<0.05 判斷為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代成骨細胞鑒定

2.1.1堿性磷酸酶染色：可見大量染色陽性細胞出現，細胞膜及胞漿內顆粒染色呈藍黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見圖1。

圖1 成骨細胞(第3代)堿性磷酸酶染色(× 40)

2.1.2茜素紅染色：細胞匯合時均呈多層重疊生長，細胞局部堆集成灶狀，形成鈣結節(jié)，茜素紅染色改結節(jié)染成橘紅色，見圖2。

圖2 成骨細胞(第3代)茜素紅染色(× 40)

2.2 藥物濃度確定

2.2.1CCK-8測定細胞增殖：不同梯度濃度柚皮苷干預液組細胞增殖率均明顯升高(2×10-4、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L組，P<0.05 ; 2×10-5mol/L組，P<0.01)。其中2×10-7mol/L組細胞增殖率最高。見圖3。

圖3 各濃度柚皮苷干預液對成骨細胞增殖率的影響

2.2.2ALP活力測定：不同梯度濃度柚皮苷干預液組ALP活力值均高于對照組(2×10-5、2×10-6、2×10-8mol/L組,P<0.05; 2×10-4、2×10-7mol/L組，P<0.01)。其中2×10-7mol/L組ALP活力值最高。見圖4。

圖4 各濃度柚皮苷干預液對成骨細胞ALP活性的影響

2.2.3各組PCNA蛋白水平表達：成骨細胞經過各組濃度梯度柚皮苷干預液干預24 h后，通過Western blot檢測蛋白PCNA表達情況，柚皮苷干預液可顯著上調PCNA蛋白表達(P<0.01)。其中2×10-7mol/L組的表達最高。見圖5。結合CCK-8細胞增殖率實驗與ALP活力測定實驗，在2×10-7mol/L濃度時，柚皮苷干預液對成骨細胞增殖分化的影響最高，在后續(xù)研究中將參照這個濃度進行相關實驗。

圖5 各組PCNA蛋白表達電泳圖及條帶量化結果

2.3 微重力下成骨細胞與T淋巴細胞直接共培養(yǎng)

2.3.1ALP活性：加藥組ALP活性顯著高于未加藥干預組(正常重力不加藥組與正常重力加藥組相比、失重不加藥組與失重加藥組相比，P<0.01)；失重組ALP活性顯著低于正常重力組(正常重力不加藥組與失重不加藥組相比、正常重力加藥組與失重加藥組相比，P<0.05)。見圖6。

圖6 各組ALP活性表達

2.3.2失重組測定PCNA蛋白表達：加藥組顯著高于未加藥組(P<0.01)，柚皮苷促進了T淋巴細胞干預下的成骨細胞增殖。進一步測定通路蛋白ERK2表達，加藥組顯著高于未加藥組(P<0.01)。表明ERK2蛋白參與此過程。見圖7。

圖7 失重組PCNA、ERK2蛋白表達電泳圖及條帶量化結果

3 討論

骨質疏松癥是一種全身代謝性骨病，其特征是骨量、骨質量和微結構退化[5]。由成骨細胞和破骨細胞共同參與的骨重建失衡導致了這種病理性骨病[6]。與化學合成的藥物相比，中醫(yī)藥用于防治骨質疏松癥因具有不良反應少、適合長期服用和治療效果穩(wěn)定的特點，逐漸成為一種主流治療手段[7]。柚皮苷是骨碎補的主要作用成分，可以有效促進骨髓基質細胞的增殖并促使其向成骨細胞分化[8]。柚皮苷的干預有效促進了已分化成骨細胞的正常功能，表現為提高骨鈣素的表達[9]。有報道[10]表明通過檢測人骨髓間充質干細胞在不同濃度柚皮苷作用下的增殖分化情況，在一定濃度范圍內，促進成骨相關的作用和柚皮苷濃度呈計量依賴關系。不同濃度梯度柚皮苷干預液作用成骨細胞后，通過CCK-8檢測細胞增殖情況、ALP活力檢測觀察細胞分化情況。此外，還進行了PCNA蛋白表達分析，以證實柚皮苷對成骨細胞增殖的影響[11]。本課題組認為柚皮苷干預液在2×10-7mol/L濃度時，對成骨細胞的增殖分化作用最佳。

骨免疫學說[4]指出，在骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的過程中，免疫系統(tǒng)參與病理和慢性病的形成。有報道[12]提出，T淋巴細胞可以刺激骨髓間充質干細胞成骨分化。同樣，柚皮苷對免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)都有一定的保護或增強作用[3]，能夠提高T淋巴細胞亞群 CD3、CD4、IL-2、TNF-α水平，而這其中一些又是骨代謝因子。柚皮苷既調節(jié)骨代謝同時又具有調節(jié)免疫的作用，而其中的免疫因子又參與了骨代謝[13]。在骨代謝方面，ERK1/2蛋白通路與IL-6、IL-2、OPG 等免疫因子有關[5,14]。因此，本研究旨在探討兩者之間的共同細胞因子在骨代謝和免疫之間的關聯(lián)及其作用。

使用Synthecon RCCS三度空間微重力培養(yǎng)系統(tǒng)構建細胞微重力環(huán)境[15]，通過分組觀察微重力和藥物對T淋巴細胞介導下的成骨細胞增殖分化的影響。在正常重力下，對比藥物對成骨細胞影響，結果表明柚皮苷干預液可以顯著提高成骨細胞的堿性磷酸酶活性，提高成骨細胞PCNA蛋白表達，促進成骨細胞增殖及分化；在柚皮苷干預下，對比重力對成骨細胞影響。在失重狀態(tài)下，其可以明顯降低成骨細胞的堿性磷酸酶活性，抑制成骨細胞分化。進一步觀察失重組通路蛋白ERK2的表達，發(fā)現柚皮苷干預組的ERK2表達遠高于對照組。說明在微重力下，T淋巴細胞介導成骨細胞在柚皮苷干預下產生的增殖分化可能與ERK2通路蛋白激活有關。