骨質疏松癥大鼠模型生物力學性能和OPG/RANKL/RANK信號通路研究

李曉婷 張悅瑤 王海豪 唐宏宇

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405

3. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院三骨科，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨微觀結構退化為特征的一種疾病[1]。如今全球OP患者人數已超過兩億，在常見病發病率排行中，OP位于第7位[2]。如何有效防治OP已成為國際上共同的公共衛生問題[3]。

目前臨床上西醫治療OP的藥物包括維生素D、辛伐他汀等[4]，這些藥物在長期使用過程中，其副作用會逐漸顯露，如導致肌肉酸痛、惡心嘔吐、加重肝臟負擔、增加罹患乳腺癌等疾病的發生率等[5-7]。近年來中醫藥對OP的預防作用及對其病情發展的延緩作用已得到肯定，但具體起效的作用機制尚未完全明確[8]。針刺具有促進骨形成、改善骨代謝等作用，但相關作用機制依舊值得深入探究[9]。

研究[10-11]顯示OPG/RANK/RANKL通路是骨代謝疾病產生的主要機制。故本文擬通過研究針刺對OP模型大鼠的生物力學性能和OPG/RANKL/RANK信號通路的影響，進而明確針刺防治OP的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器：ZF-208凝膠成像(恒勤儀器設備有限公司，上海)；醫用離心機(Beckman公司，美國)；Dexa Pro-1型雙能X射線骨密度儀(GE公司，美國)；JS-Power300型電泳儀(迪奧生物科技有限公司，上海)；毫針(Hwato，0.25 mm×13 mm)，HANS-200A 電針儀(南京濟生)。

1.1.2藥品與試劑：阿侖膦酸鈉片(C14202011827，批準文號：國藥準字J20130085；規格：70 mg/片，Merck Sharp & Dohme Italia SPA)；OPG檢測試劑盒(百奧萊博科技有限公司，北京，批號：ZN2789)；血清Ca2+、P的ELISA試劑盒(百奧萊博科技有限公司，北京，批號分別為：ZN2746、ZN2731)；Western blotting試劑盒(批號：ED1963r)、羊抗鼠RANK多克隆抗體(批號：sc-374360，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠RANKL多克隆抗體(批號：sc-377079，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠OPG多克隆抗體(批號：sc-390518，Santa Cruz Biotechnology)、HRP標記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(批號：jx-1932，純度：>95 %)、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(批號：sc-47724，Santa Cruz Biotechnology)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號：ED2571r)均購自廣州輝旺生物科技有限公司。

1.1.3實驗動物：50只6月齡的健康SD大鼠，SPF級，雌性，體質量為160～200 克，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供[實驗動物生產合格證編號：SCXK(粵)2018-0034]。動物實驗室溫度為(22±2)℃、相對濕度50 %。本研究已獲廣州中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1分組、造模與給藥：將大鼠隨機分為手術組(40只)和假手術組(10只)。對其進行為期4 d的適應性飼養后，將手術組大鼠采用雙側卵巢摘除法建立OP模型[12-13]，術后正常飼養，2個月后開始藥物干預，連續給藥12周。將手術組大鼠隨機分為模型組、針刺低劑量組、針刺高劑量組以及阿侖膦酸鈉組，假手術組大鼠作為空白組；阿侖膦酸鈉組根據人與大鼠體表面積換算給予阿侖膦酸鈉片[7.35 mg/(kg·d)]灌胃治療；假手術組、模型組、針刺低劑量組和針刺高劑量組均給予灌胃等量的生理鹽水(給藥體積均為1 mL/100 g)；針刺低劑量組和針刺高劑量組按文獻[14]取穴，針刺低劑量組：暴露相關穴位(“腎俞穴”及“足三里穴”)，定位準確后將毫針快速刺入，連接電針儀，疏密波，其中針刺低劑量組干預時長為15 min，針刺高劑量干預時長為30 min，每日1次。

1.2.2大鼠骨礦含量和骨密度檢測：末次給藥結束后24 h，注射戊巴比妥至大鼠腹腔，待其麻醉后，處死大鼠，取右側股骨和第4腰椎進行研究，將右側股骨置于雙能X線骨密度儀器上檢測骨礦含量水平。另外，將右側股骨和腰椎置于X線骨密度儀器下掃描，計算骨密度含量。

1.2.3大鼠血清Ca2+、P和OPG、RANKL、RANK的水平：大鼠血清中Ca2+、P、OPG、RANKL、RANK等水平采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測。從大鼠的腹主動脈取血5 mL，室溫放置1 h，然后以3 000 r/min離心20 min，分離血清。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4股骨生物力學性能檢測：采用三點彎曲測試評估。處死大鼠后，將完整的股骨從大鼠體內取出，置于生物力學萬能實驗機上，以每分鐘2 mm的速度使實驗機壓頭下壓，直到股骨受力面出現裂縫。進行數據收集，并測量股骨剛度等數值。

1.2.5大鼠骨組織中OPG、RANKL、RANK蛋白檢測：將大鼠處死，取右側股骨洗凈磨碎，加入裂解液后離心，提取待測股骨中各細胞蛋白，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品(50 μg)加到 SDS-PAGE凝膠孔內，20 μL/孔，用280 mA 電流轉膜1 h。取出PVDF膜，TBST洗3次×5 min，后將膜放入5 %的脫脂奶粉中，并于室溫條件下避光密閉儲存2 h。封閉結束后，將膜取出，再次用TBST 浸洗3次×5 min，加入OPG、RANKL、RANK的一抗稀釋液(稀釋度為1∶1 000)，4 ℃儲存過夜。加入二抗稀釋液(稀釋度為1∶200)，室溫孵育1h。顯色后，成像，并采用Image J v l.5.l軟件分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行收集數據的統計分析。當數據符合正態分布且方差具有同質性時，多個組間比較采用單因素方差分析。若數據不能達到正態分布的要求或方差不具有同質性時，則采用非參數檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 針刺對OP大鼠骨組織中骨礦含量、血清Ca2+和血清P的影響

研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中骨礦含量、血清Ca2+及血清P水平與明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，針刺的低劑量組、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中骨礦含量升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，針刺低劑量組大鼠血清Ca2+和P的表達無明顯升高，差異無統計學意義(P>0.05)，針刺高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠血清Ca2+和P的表達明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠骨組織中骨礦含量和血清Ca2+、P水平測定結果

2.2 針刺對OP大鼠血清中OPG、RANKL和RANK水平的影響

結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清OPG表達明顯降低(P<0.01)，血清RANKL和RANK表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺的低劑量組、高劑量組和阿侖膦酸鈉陽性對照組大鼠血清OPG的表達較模型組升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠血清RANKL和RANK的表達降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；與阿侖膦酸鈉組比較，針刺高劑量組大鼠血清RANKL和RANK的表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)，表明針刺抑制骨質疏松大鼠血清RANKL和RANK的表達呈現明顯的劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠血清OPG、RANKL和RANK水平的測定結果

2.3 針刺對OP大鼠右側股骨最大載荷、股骨剛度及彈性模量的影響

和假手術組比較，模型組大鼠股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量數值明顯降低(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠股骨最大載荷、股骨剛度的數值升高明顯(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明經過針刺干預后，療效明顯，而針刺低劑量組大鼠彈性模量的數值無明顯升高(P>0.05)，針刺高劑量組和阿侖膦酸鈉組升高明顯(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠生物力學性能測定結果

2.4 針刺對OP大鼠股骨和腰椎BMD含量的影響

和假手術組比較，模型組大鼠股骨和腰椎的BMD含量明顯降低(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠股骨和腰椎的BMD含量升高明顯(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明經過針刺干預后，療效明顯。見表4。

表4 各組大鼠骨密度測定結果

2.5 針刺對OP大鼠骨組織中OPG、RANKL和RANK蛋白的影響

和假手術組比較，模型組大鼠OPG蛋白表達明顯降低(P<0.01)，RANKL、RANK蛋白表達明顯升高(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組的OPG蛋白表達升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，RANKL、RANK蛋白的表達降低(P<0.05或P<0.01)；和阿侖膦酸鈉組比較，針刺高劑量組大鼠OPG蛋白的表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)，而RANKL、RANK蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表5，圖1。

表5 各組大鼠骨組織中蛋白的相對表達量測定結果

圖1 各組大鼠骨組織中OPG、RANKL、RANK蛋白表達電泳圖

3 討論

關于OP，中醫并沒有相對應的病名，根據其臨床表現，可將其歸屬于“骨痿”的范疇[15]。主要病因有：腎虛精虧、脾虛導致氣血生化不足等[16]。在臨床中，OP的中醫治法以補腎健脾為主[17-21]。阿侖膦酸鈉是臨床治療OP的一線藥物[22]，故本研究以阿侖膦酸鈉為陽性藥對照，評價針刺治療OP的療效。有研究[23-24]表明“腎俞穴”“三陰交穴”“關元穴”及“足三里穴”是補腎健脾重要穴位，可增強骨密度，對于OP的生理病理有重要的影響，但具體作用機制未明確。

OPG/RANK/RANKL信號通路在調節成骨細胞(osteoblast，OB)與破骨細胞(osteoclast，OC)的成熟與分化過程中起到重要作用，該通路通過維持、調控OB與OC間動態平衡影響OP的發生與發展[25-26]。在骨組織中，OB分泌的OPG為RANKL的高親和力誘餌樣受體，與RANKL有較強結合能力，故OPG可減少 RANKL與破骨細胞分化因子受體RANK的結合，影響RANK-RANKL途徑，使OC轉錄活化信號生成減少，從而抑制OC生成和成熟，并降低OC的活性[27]。若機體RANKL表達水平增高，OPG表達水平下降，則RANKL與RANK結合受到促進，OB收到RANK-RANKL途徑產生的轉錄活化信號，刺激前破骨細胞分化為OC，從而促進OC的形成、分化、成熟，進而促進骨吸收量的增加，最終導致骨組織損傷，以及OP的發生[28]。

本研究結果顯示，針刺可升高OP模型大鼠股骨骨礦、血清Ca2+和P含量，對股骨有明顯改善作用，表明針刺增加了OP模型大鼠的骨礦含量，減少了鈣、磷丟失，改善了生物力學性能；同時，針刺可以通過調控OPG/RANKL/RANK途徑的傳導，對OC的增殖分化產生抑制作用，進而降低OP模型大鼠的骨吸收量，減少Ca2+、P丟失，間接達到增加骨骼骨礦含量的效果，從而達到降低或延緩OP的發生發展。

綜上所述，針刺能夠通過上調OPG表達，阻礙RANKL-RANK途徑的表達，降低OC的生成，從而增加骨形成量，降低骨吸收量，進而達到減少鈣磷丟失、提高骨骼骨礦含量、改善骨骼生物力學性能的效果。