益生菌制劑通過PI3K/Akt信號通路改善骨質疏松大鼠的骨代謝和骨量

劉旭良 周元敏 曾祥英 王兆杰 宋慧東 李伯庭

1. 廣州市第十二人民醫院骨外科，廣東 廣州 510620

2. 廣州市第十二人民醫院放射科，廣東 廣州 510620

3. 廣州市第十二人民醫院供應室，廣東 廣州 510620

4. 廣州市第十二人民醫院消化內科，廣東 廣州 510620

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨質被破壞為特征的一種代謝異常性疾病，骨脆性增加引起的骨折是導致老年患者致死及致殘的重要原因之一[1]。有研究[2]認為腸道菌群失調產生的大量炎癥因子是導致OP患者破骨細胞骨吸收亢進、骨量丟失加重的易感因素。益生菌是對人體腸道機能有益的一類微生物的總稱，可糾正腸道菌群失調，抑制炎癥反應，維持腸道正常生理功能[3]。用益生菌制劑糾正腸道菌群失調及骨代謝異常，可能是治療OP的一種新思路。但益生菌制劑通過何種途徑預防、治療及影響骨代謝，目前還不十分明確。

PI3K/Akt信號通路是參與炎癥反應、細胞增殖凋亡及骨代謝異常的關鍵通路。已有研究證實，腸道菌群失調介導的腸炎癥反應過程中，PI3K/Akt活化可加重腸道功能紊亂[4]，且PI3K/Akt通路活化可抑制FoxO1的磷酸化活化及核轉位，而引起破骨細胞死亡，影響骨代謝[5]，提示PI3K/Akt的活化可能是腸道菌群調節骨代謝過程中的潛在調節機制。本研究擬從PI3K/Akt信號通路方面，探究益生菌制劑干預治療OP大鼠的骨代謝異常的潛在機制，以期為OP的抑菌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及儀器：白色念珠菌(貨號：LA9490，北京索萊寶科技有限公司)；PI3K/AKT通路激活劑(貨號：M03755-LUP，北京百奧萊博科技有限公司)；益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯活菌(媽咪愛)(貨號：S20020037，0.5 g/片，北京韓美藥品有限公司)；革蘭氏染液(貨號：D008，上海雅吉生物科技有限公司)；白細胞介素(IL)-6、IL-1、Ⅰ型原膠原氨基端延長肽(PINP)、β膠聯降解產物(β-CTX)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)等ELISA試劑盒購自上海心語生物科技有限公司；HE及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色液(貨號：SY2022及T6823，北京伊塔生物科技有限公司及無錫菩禾生物醫藥技術有限公司)；PI3K、Akt、叉頭框蛋白O(FOXO)、骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANKL)等兔抗大鼠抗體均購自美國abcam公司；DPX-NT雙能骨密度儀購自美國Lunar公司；菌落計數器購自西班牙IUL公司。

1.1.2實驗動物：1月齡健康雄性SD大鼠90只，體重200～220 g，購自廣東至遠生物醫藥科技有限公司[生產許可證號：SCXK(粵)2021-0057]，于廣州市第十二人民醫院動物房中常規飼養。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定，經廣州市第十二人民醫院動物倫理委員會批準[批號：IACUC-01(202101015)]，符合3R原則。

1.2 方法

1.2.1動物處理及分組：取SD大鼠75只，參照文獻[6]灌胃109cfu/mL的白色念珠菌50 μL，1次/d，共7 d，建立腸道菌群失調模型(糞便含水量顯著增高，糞便桿球菌比例低于1∶1，為造模成功)共75只，并隨機分為模型組、益生菌制劑組、PI3K/AKT通路激活組、益生菌+通路激活組，另取15只大鼠予以自由飲用無菌生理鹽水，作為正常對照組。正常對照組及模型組大鼠在分組后自由飲用無菌生理鹽水；益生菌制劑組參照文獻[7]按1 mL/200 g體重灌胃給予益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯活菌，連續14 d；PI3K/AKT通路激活組參照文獻[8]經腹腔注射PI3K/AKT通路激活劑-rh IGF(20 μg/kg)，1次/d，連續14 d進行干預治療；益生菌+通路激活組腹腔注射PI3K/AKT通路激活劑-rh IGF的同時，灌胃給予益生菌制劑進行治療。

1.2.2腸道菌群檢測：收集大鼠新鮮糞便，精密稱重后置于烘箱中烘干至恒重，檢測含水量(%)=(烘干前重量-烘干后重量)/烘干前重量×100 %。用無菌竹簽在潔凈載玻片上涂布糞便，厚薄適宜，待自然干燥后固定，行革蘭染色，用顯微鏡[100(物鏡)×10(目鏡)]觀察記錄菌群分布。

1.2.3血清血指標檢測：將大鼠麻醉后，取腹主動脈血2 mL，按ELISA試劑盒說明書方法檢測IL-6、IL-1、PINP、β-CTX、ALP及OC水平。

1.2.4骨質指標檢測：運用DPX-NT雙能骨密度儀對大鼠右側股骨頸進行掃描(分辨率1.0 mm×1.0 mm，速度60 mm/s)以檢測骨密度；處死大鼠，取右側股骨，剔除表面的結締組織，于馬弗爐中550 ℃灰化至恒重，取出用分析天平稱取重量。取左側股骨頭，置入10 %中性甲醛固定液固定24 h，30 %甲酸脫鈣3 d，梯度乙醇脫水、二甲苯透明2 h，石蠟包埋，制成4 μm切片，常規HE及TRACP染色，制成病理標本，在400倍顯微鏡下觀察，運用Image-pro-plus圖像系統分析單位面積內TRACP染色切片中破骨細胞數目。

1.2.5Western blotting檢測蛋白表達：將左后側股骨頭置于液氮中凍存后敲碎，在液氮液中碾磨成粉末，加入預冷的RIPA裂解液裂解，蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，制膠后，取20 μg蛋白行電泳、轉膜(PVDF膜)反應，5 %脫脂奶粉封閉操作后，加入1∶600的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1、OPG、RANKL一抗及β-actin(1∶1 200)內參抗體4 ℃孵育過夜，羊抗兔辣根過氧化物酶二抗(1∶1 600)室溫孵育0.5 h，顯影液和定影液浸泡PVDF膜，晾干后，運用ImageJ軟件分析條帶相對灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 益生菌制劑對大鼠糞便含水量及腸道菌群的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌減少(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌降低(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌較模型組升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌較模型組減少(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌較益生菌制劑組升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌(、乳酸桿菌較益生菌制劑組減少(P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠糞便含水量及腸道菌群比較

2.2 益生菌制劑對大鼠血清炎癥因子及骨生物學指標的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平降低(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平較模型組升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平較益生菌制劑組升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平較益生菌制劑組降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠血清炎癥因子及骨生物學指標比較

2.3 益生菌制劑對大鼠骨密度及骨灰質量的影響

與正常對照組[(226.17±12.42)mg/cm3,(769.86±25.93)mg]相比，模型組大鼠骨密度[(165.31±10.36)mg/cm3]及骨灰質量[(640.32±20.21)mg]降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠骨密度[(216.00±14.48)mg/cm3]及骨灰質量[(747.48±27.94)mg]升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠骨密度[(105.34±8.66)mg/cm3]及骨灰質量[(569.64±17.86)mg]較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠骨密度[(177.28±15.08)mg/cm3]及骨灰質量[(667.62±27.30)mg]較益生菌制劑組降低(P<0.05)。

2.4 益生菌制劑對大鼠骨病理學變化的影響

HE染色可見，正常對照組大鼠骨小梁排列有序且結構致密。模型組大鼠可見股骨遠端骨小梁排列稀疏且減少，骨細胞結構模糊。益生菌制劑組大鼠骨小梁及骨細胞結構趨于正常，PI3K/AKT通路激活組大鼠骨小梁間隔增寬，粗細不均勻。益生菌+通路激活組大鼠骨小梁變化較模型組相近，見圖3。

TRACP染色可見，破骨細胞陽性染色呈粉紅色，模型組可見破骨細胞數目增多，骨吸收陷窩增大，破骨細胞數目[(16.38±1.05)個/mm2]高于正常對照組[(4.17±0.42)個/mm2],P<0.05。益生菌制劑組大鼠破骨細胞數目[(7.00±0.78)個/mm2]較模型組減少(P<0.05)，PI3K/AKT通路激活組大鼠破骨細胞數目[(25.28±2.06)個/mm2]較模型組進一步升高(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠破骨細胞數目[(16.08±1.08)個/mm2]較益生菌制劑組增多(P<0.05)，見圖3。

圖3 股骨遠端組織HE與TRACP染色圖(×400)

2.5 益生菌制劑對大鼠PI3K/Akt/FOXO1通路蛋白及RANKL/OPG表達的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達升高(P<0.05)，OPG表達降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG降低(P<0.05)，OPG表達升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達較模型組升高(P<0.05)，OPG表達較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達較益生菌制劑組升高(P<0.05)，OPG表達較益生菌制劑組降低(P<0.05)，見圖4，表1。

表1 大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG及OPG表達比較

圖4 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FOXO1、FOXO1、RANKL、OPG蛋白表達免疫印跡圖

3 討論

臨床上常用促進骨形成藥物或抑制骨吸收藥物來糾正OP引起的骨代謝失衡，但這些藥物雖能在一定程度上抑制骨量丟失的進一步惡化，但卻并不能使丟失的骨量恢復[9]。腸道菌群可通過消化系統的分泌與吸收、機體的免疫調節，來影響雌激素類似物分泌及骨質形成微量元素如鈣、磷的吸收及代謝、骨鈣形成等過程[10]。相關研究還發現，炎性因子如IL-6和TNF-α是強烈的骨吸收刺激因子，老年OP患者或絕經后OP女性患者IL-6和TNF-α的升高，可抑制OPG產生，導致RANKL/OPG比例增加，破骨細胞吸收加速而出現骨丟失；而腸道菌群失調后可誘導腸內炎癥的應答，導致IL-6和TNF-α等溶骨性細胞因子大量釋放，這也解釋了腸炎患者更易患OP的可能原因[11]。PINP是反應骨形成的指標，β-CTX可降解PINP而可用于骨吸收的判定。本研究發現，大鼠出現糞便含水量增加、糞便中腸桿菌、白色念球菌等致病菌升高，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌減少等腸道菌群失調癥狀后，也出現OP癥狀(IL-6和TNF-α升高，ALP、OC、PINP等促骨形成因子減少，β-CTX及破骨細胞骨吸收升高，RANKL/OPG比例增加，股骨骨密度、骨灰質減少，股骨遠端松質骨小梁斷裂及骨細胞減少等病理損傷嚴重)，提示腸道菌群失調性OP模型造模成功。

益生菌可激發糖類細菌活性、增加有機酸分泌、提高腸道酸性微環境、增強腸道抗菌能力、抑制病原菌生長繁殖，而維持腸道功能及菌群平衡。已有研究發現益生菌可抑制炎癥反應，來降低破骨細胞形成，繼而減少骨破壞，并逆轉成骨細胞減少[12]。卵巢切除鼠補充益生菌制劑-鼠李糖乳桿菌可改善腸道通透性，減輕腸道炎癥，改善骨密度[13]。Delgado-Ruiz等[14]發現益生菌治療法可通過抑制IL-6分泌及腸道炎癥反應，來抑制卵巢去勢小鼠破骨細胞活性，而增加骨量，提示用益生菌制劑來治療OP可能是未來的新趨勢。本研究發現，用益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯活菌灌胃治療后，大鼠糞便含水量及致病菌降低，益生菌升高提示菌群趨于正常，大鼠OP癥狀也較模型組明顯緩解，證實腸道菌群調節劑-益生菌制劑可能成為治療骨質疏松癥的新靶點。

PI3K/Akt通路是參與炎癥反應及骨代謝失衡的關鍵通路之一。大量研究發現腸道菌群失調后，血漿及腸道組織內IL-6和TNF-α升高可刺激PI3K活化，PI3K通過D3-磷酸肌醇PH結構域促進Akt磷酸化，并負性調節肌醇-5-磷酸酶(SH2)，促進破骨細胞前體存活、分化、成熟及骨吸收，且PI3K/Akt通路的活化可通過誘導胱硫醚-β-合成酶(CBS)及轉錄因子Sp1表達來生成內源性硫化氫，從而抑制腸道動力、加速腸通透性損傷及細菌移位，導致機體更為嚴重的炎癥反應[15-16]。另外，PI3K/Akt通路下游FoxO1活化可與激活轉錄因子4(ATF4)相互作用，來促進防御蛋白合成，而抵抗骨骼內的應激反應，維持成骨正常增殖，但PI3K/Akt通路的磷酸化途徑活化，可直接阻斷FoxO1依賴的DNA結合能力受損，引起成骨細胞凋亡、破骨細胞生成及骨吸收控制節點失衡，導致骨代謝異常及OP發生[17]。本研究發現，大鼠腸道菌群失調后，股骨組織中PI3K/Akt通路磷酸化活性升高，p-FoxO1升高而FoxO1活性降低，破骨細胞活性升高(破骨細胞數目增多，RANKL/OPG比例增加)，而用激活劑進一步促進PI3K/Akt通路磷酸化活性后，FoxO1活性進一步降低，大鼠表現出更為嚴重的OP及菌群失調現象，提示PI3K/Akt通路活性升高，可加重腸道菌群失調及骨丟失。益生菌制劑干預治療組，PI3K/Akt通路處于抑制狀態，其菌群失調及骨丟失現象最輕，PI3K/Akt通路激活劑可明顯減弱益生菌制劑的抗OP及菌群失調作用。

綜上所述，益生菌制劑干預治療，可減弱大鼠菌群失調并糾正OP引起的骨代謝異常，且其作用可能與抑制PI3K/Akt通路激活有關。這為有效防治腸道菌群失調誘導的骨量減少及OP的治療提供新的思路，但腸道菌群失調患者極多，菌群種類繁雜，臨床表現復雜多變，缺少特異性，PI3K/Akt通路在成骨及破骨中的調控作用爭議也較多，腸道菌群引起骨量減少的具體機制還需進一步探究。