水蛭素上調VEGF/Notch1信號通路促進人骨髓間充質干細胞成骨分化

任錕 吉鴻濤 韓磊 李彥杰

河南省中醫院康復科，河南 鄭州 450000

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是從骨髓中分離出來的干細胞，具有自我復制和多項分化的潛能[1]。誘導BMSCs向成骨細胞分化，是目前干細胞研究領域的熱點之一。研究表明多種單味或復方中藥能夠調控BMSCs的成骨分化[2]。水蛭是一種傳統中藥，具有活血破瘀通經消積等功效，在骨科疾病治療中有廣泛的使用[3]。有研究表明水蛭能夠提升骨損傷大鼠骨愈合相關基因的表達并促進骨折愈合[4]。目前還未有研究探討水蛭對骨髓間充質干細胞的影響。水蛭素是水蛭的提取物和活性成分[5]，本課題觀察水蛭素對BMSCs細胞成骨分化的影響，并探討其分子機制，為水蛭素的藥理研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人骨髓間充質干細胞BMSCs(ATCC? PCS-500-012?)購于美國菌種保藏中心；水蛭素凍干粉購于上海源葉生物科技有限公司(批號：S31625)；BCIP/NBT染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：I023-1-1)；茜素紅染色液購于上海尚寶生物科技有限公司(批號：R23312)。Runx2(sc-390351)、Osterix(sc-393325)、COL1A1(sc-59772)、VEGF(sc-7269)、Notch1(sc-376403)、Jagged1(sc-390177)、CBF1(sc-271128)、β-actin(sc-84322)蛋白一抗和二抗(sc-2005)購于美國Santa Cruz公司。

1.2 MTT檢測細胞增殖

實驗于河南省中醫院中心實驗室完成。BMSCs細胞常規培養于含有10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素和鏈霉素的DEME培養基中，置于37 ℃、5% CO2環境下培養。水蛭素凍干粉用DEME培養基配置為20 ATU/mL的母液。取對數期生長的BMSCs細胞分組培養。對照組：正常培養的BMSCs細胞；誘導組：細胞培養基中加入成骨誘導液(含100 mmol/L地塞米松，50 mg/L維生素C和10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉)；水蛭素組：細胞培養基加入成骨誘導液的同時分別加入低濃度(1 ATU/mL)、中濃度(10 ATU/mL)或高濃度(20 ATU/mL)水蛭素。每24 h換液一次，培養7 d。棄去原有培養基后每孔加入終濃度為5 g/L的MTT，37 ℃常規培養4 h。棄去上清，隨后在每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使結晶充分溶解。酶標儀(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)在490 nm波長處檢測吸光度值。實驗重復3次，細胞增殖率=(OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞分組培養一周后，加入0.5%胰蛋白酶進行消化收集細胞。加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)。避光染色后上機檢測細胞凋亡率。

1.4 RT-PCR檢測mRNA表達

細胞分組培養一周后，Trizol試劑盒提取總RNA并檢測其濃度。反轉錄獲得cDNA，PCR檢測基因的表達。反應條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共進行45個循環，隨后72 ℃延伸10 min。以內參基因β-actin為對照，用2-ΔΔCt法計算基因mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 BCIP/NBT試劑盒檢測堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平采用BCIP/NBT試劑盒進行檢測。將BMSCs細胞以1×105個/孔接種于24孔板中，24 h后加入成骨誘導液和水蛭素分組處理，培養一周后，按試劑盒說明加入BCIP/NBT工作液進行染色，用PBS清洗后觀察染色結果。實驗重復3次。

1.6 茜紅素染色檢測礦化結節

細胞分組培養一周后，加入40 g/L的多聚甲醛在室溫下孵育20 min，隨后使用茜素紅染色液于37 ℃染色5 min，倒置顯微鏡下觀察細胞礦化結節并記錄。

1.7 Western blot檢測

BMSCs細胞分組培養一周后，加入PBS緩沖液清洗3次，隨后加入蛋白裂解液反應30 min，然后用SDS-PAGE電泳分離蛋白。轉膜1 h后，加入5%脫脂牛奶在室溫下進行1 h的封閉。分別加入待測蛋白一抗4 ℃過夜，加入二抗室溫孵育1 h。用凝膠成像儀對條帶進行定量分析。實驗重復3次。

1.8 統計學分析

用 SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析，結果以均數±標準差表示，實驗數據用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水蛭素對骨髓間充質干細胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組相比，加入成骨誘導液培養的誘導組BMSCs細胞增殖顯著提升(P<0.05)。誘導培養基中添加低劑量的水蛭素后，BMSCs的細胞增殖較對照組沒有明顯改變，但在中劑量和高劑量水蛭素處理組中，細胞增殖提升，差異有統計學意義(P<0.05)。并且與中劑量水蛭素組相比，高劑量水蛭素組細胞增殖升高，差異有統計學意義(P<0.05)。在后續實驗中，選取高劑量20 ATU/mL作為水蛭素處理濃度。

圖1 水蛭素對骨髓間充質干細胞增殖的影響

2.2 水蛭素對骨髓間充質干細胞凋亡的影響

如圖2所示，誘導組細胞凋亡低于對照組，水蛭素組BMSCs細胞凋亡低于誘導組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 水蛭素對骨髓間充質干細胞凋亡的影響

2.3 水蛭素對骨髓間充質干細胞成骨分化基因表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，誘導組BMSCs細胞中成骨基因Runx2、Osterix和COL1A1的mRNA和蛋白表達均顯著提升(P<0.05)。同時，加入水蛭素處理的BMSCs細胞中成骨基因的mRNA和蛋白表達高于誘導組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 水蛭素對骨髓間充質干細胞中成骨基因表達的影響

2.4 水蛭素對骨髓間充質干細胞中ALP蛋白表達的影響

BCIP/NBT染色測定ALP蛋白表達，結果見圖4。與對照組相比，誘導組ALP表達顯著增多。同樣，水蛭素組的ALP蛋白表達較誘導組顯著提升。

圖4 水蛭素對骨髓間充質干細胞中ALP蛋白表達的影響(×100)

2.5 水蛭素對骨髓間充質干細胞中礦化結節的影響

如圖5所示，茜紅素染色后觀察BMSCs細胞，對照組和誘導組均未見明顯礦化結節，但誘導組較對照組顏色加深。水蛭素細胞可見明顯大小不一的紅褐色礦化結節。

圖5 水蛭素對骨髓間充質干細胞中礦化結節的影響(×200)

2.6 水蛭素對骨髓間充質干細胞中VEGF/Notch1信號通路的影響

如圖6所示，與對照組比較，誘導組和水蛭素組BMSCs細胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表達量均升高，并且水蛭素組高于誘導組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6 水蛭素對骨髓間充質干細胞中VEGF/Notch1信號通路的影響

3 討論

骨髓干細胞因其在自體移植和體外培養等多方面的優勢，在多種疾病的臨床治療中具有重要的應用前景[6]。中醫臨床上常用多種中藥治療促進骨損傷愈合，研究也證實了多種中藥可通過提升骨髓間充質干細胞的成骨分化促進骨愈合[7]。有研究表明水蛭素可應用在骨愈合、骨關節炎及其他骨科疾病的治療中，但關于其作用機制的研究較少[8]。

本研究選取人骨髓間充質干細胞BMSCs為靶標進行水蛭素藥理作用研究。加入成骨誘導液的BMSCs細胞增殖水平顯著提升，說明成骨誘導能夠提升BMSCs的細胞增殖，此結果與前人一致[9]。水蛭素在低濃度時對細胞增殖沒有影響，但是中高濃度的水蛭素明顯促進成骨誘導BMSCs細胞的增值，可見水蛭素對BMSCs細胞增殖的提升作用具有一定的濃度依賴性。后續實驗中選取了對BMSCs細胞增殖影響效果更大的高濃度水蛭素進行。成骨細胞分化成熟過程中也伴隨著細胞凋亡的減少[10]。本實驗結果發現水蛭素降低了成骨誘導的BMSCs細胞凋亡。

Runx2是成骨細胞分化早期的重要標志物之一，可激活一系列下游成骨基因的轉錄，參與成骨分化的調節[11]。Osterix和COL1A1在骨形成的膠原蛋白分泌和骨鈣化等過程中起重要作用，同樣是成骨分化的重要參與因子[12]。本研究發現水蛭素促進成骨誘導的BMSCs細胞中Runx2、Osterix和COL1A1的表達，證明水蛭素和成骨分化之間的聯系。另外，ALP和礦化結節常被用于檢測骨髓間充質干細胞分化水平[13]。本研究中水蛭素的處理明顯提升了BMSCs細胞中ALP的水平，并且在加入水蛭素處理的細胞中，觀察到明顯的礦化結節。以上結果表明，水蛭素對BMSCs細胞的成骨分化有促進作用。

在骨愈合大鼠模型中，發現水蛭素可以正向調節VEGF的表達[4]。另有研究表明，水蛭素在血管內皮細胞中激活VEGF/Notch1信號通路[14]。VEGF/Notch1信號通路參與骨髓間充質干細胞分化的調節[15]。VEGF對BMSCs的增殖和分化均有促進作用[16]。成骨分化過程中，Notch1通路中的受體和Jagged1配體結合激活信號轉導途徑，進而激活下游因子CBF1的表達，促進細胞向成骨方向轉化[17]。本研究結果顯示，水蛭素顯著提升了成骨誘導的BMSCs細胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表達，提示水蛭素對細胞成骨分化的調節作用可能是由上調VEGF/Notch1通路產生的。成骨分化的過程被多種細胞因子和信號通路所調節[18]。在今后的研究中應進一步實驗確認水蛭素對VEGF/Notch1的調控在成骨分化中的作用，并探索水蛭素對其他成骨分化相關信號通路的影響。

綜上，本研究以水蛭素對人骨髓間充質干細胞的作用為切入點，在成骨誘導的BMSCs細胞中測定出其對細胞增殖有促進作用，對細胞凋亡有抑制作用，提升細胞中成骨基因Runx2、Osterix和COL1A1的表達，同時促進細胞中ALP水平的提升和礦化結節的生成，并且上調細胞中VEGF/Notch1信號通路。此結果說明水蛭素能夠促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化，并且其作用可能是通過激活VEGF/Notch1通路產生的，為理解水蛭素的藥理作用提供理論依據。今后，還需進一步建立動物模型探索水蛭素對骨髓間充質干細胞的作用，并探索其作為單方中藥試劑或輔助試劑對骨科疾病可能的治療作用。