骨質(zhì)疏松癥中骨相關細胞自噬的作用及其靶向治療

薛海鵬 李志超 吳燕 徐展望

1. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014

2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

3. 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，給衛(wèi)生保健和社會帶來巨大負擔。其特點是由于絕經(jīng)、衰老和相關藥物不良反應等多種因素引起的骨量和微結構喪失，導致骨組織退化和骨脆性增加[1]。一項基于我國居民OP流行病學調(diào)查[2]結果顯示，50歲以上人群OP患病率為19.2 %，65歲以上人群的患病率則高達32.0 %，已經(jīng)成為我國的重要健康問題之一。OP的發(fā)生發(fā)展與骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常變化息息相關，骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)主要由骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化而來的成骨細胞(osteoblasts,OBs)與破骨細胞(osteoclasts, OCs)激活同步的復雜機制維持，從而將骨形成與骨吸收耦合起來[3]。在正常情況下，骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡使骨代謝保持穩(wěn)定，當平衡被打破時，就可能造成骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常變化，最終導致OP發(fā)生。自噬是一種應激反應性的分解代謝過程，在維持細胞和組織穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。越來越多的證據(jù)[4]表明，自噬與骨穩(wěn)態(tài)之間的重要關聯(lián)是由BMSCs、OBs、OCs介導的，自噬在OP發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。本文擬對OP與自噬之間相關關系的研究展開探討，旨在更好地理解這兩個過程之間的相關性，并總結基于細胞自噬防治OP的不同方式以及面臨的挑戰(zhàn)。

1 骨相關細胞自噬與骨質(zhì)疏松癥

自噬發(fā)生在每個細胞中，是維持細胞活力的基礎機制，其過程分為自噬啟動、自噬體延長和成熟、自噬體降解和回收幾個階段，這一動態(tài)循環(huán)過程被稱為自噬通量，在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。骨骼功能作用的發(fā)揮需要骨組織的長期穩(wěn)定,在BMSCs、OBs、OCs協(xié)同作用下，骨組織不斷被重塑。骨重塑對于微骨折的修復以及骨骼對不同機械刺激的適應和鈣穩(wěn)態(tài)是必要的，這一過程中的任何不平衡，使骨再吸收超過形成，都可能導致骨丟失和OP的發(fā)生[5]。而自噬與BMSCs、OBs、OCs增殖分化、功能發(fā)揮密切相關，自噬水平的變化關系著骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化，被認為是OP發(fā)病的關鍵因素。

1.1 自噬在BMSCs中的作用

BMSCs具有分化為多種骨相關細胞的能力，其異常分化在OP發(fā)病機制中起著關鍵作用[6]。氧化應激是由活性氧(reactive oxygen species, ROS)過度生成引起的，過度氧化應激造成BMSCs衰老和凋亡,抑制成骨分化，導致骨形成缺陷[7]。而提高自噬水平可通過拮抗細胞凋亡來抑制ROS誘導的細胞死亡，延緩BMSCs衰老，維持其干性[8]。同時，BMSCs分化需要不斷增加的能量，自噬降解產(chǎn)物可作為細胞代謝的可選營養(yǎng)源循環(huán)利用。未分化BMSCs存在高水平自噬活性，在早期成骨分化過程中，BMSCs胞體內(nèi)也有大量自噬體聚集，表明自噬是BMSCs分化過程中一個有效能量補給途徑[9]。而老年BMSCs更容易分化為脂肪細胞而非OBs，其自噬活性降低，使用自噬抑制劑3-MA可減少BMSCs向OBs分化和增殖，而激活劑雷帕霉素則可逆轉(zhuǎn)這一過程[10]。說明通過調(diào)整自噬，恢復BMSCs成骨分化能力可以有效減少OP患者骨丟失，這為OP提供了一項潛在治療策略。

1.2 自噬在OBs中的作用

OBs來源于BMSCs，其數(shù)量或活性失調(diào)與OP等骨疾病的病理生理機制相關，而自噬對OBs各項功能均具有重要影響。一方面，自噬可作為OBs的細胞保護反應，通過降解受損細胞器保護OBs免受細胞毒性刺激。氧化應激是OBs骨形成受損的重要原因，自噬的激活限制OBs內(nèi)ROS水平并消除受損線粒體，挽救細胞凋亡[11]。并且，OBs中的自噬也在酸性pH[12]和炎癥環(huán)境[13]等刺激下觸發(fā)，以防止細胞凋亡。另一方面，自噬調(diào)節(jié)OBs參與的骨形成和重塑作用。ATG5、ATG7和Beclin-1是自噬過程的必需基因，在體外，ATG7和Beclin-1缺乏顯著降低OBs礦化[14]，OBs中ATG5缺失會降低體外礦化能力，并導致體內(nèi)骨體積減少[14-15]。同樣，另一項研究發(fā)現(xiàn)[16]，沉默ATG5可抑制OBs增殖和分化，并且更容易受到氧化應激損害，而ATG5過表達增強OBs抗氧化能力，減少細胞凋亡。這說明自噬介導BMSCs向OBs分化的過程,并且調(diào)控OBs活性、凋亡、增殖、分化以及骨基質(zhì)礦化，在維持骨微結構和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。

1.3 自噬在OCs中的作用

OCs來源于單核造血系，主要受巨噬細胞集落刺激因子(monocyte colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB配體受體激活劑(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)調(diào)控，兩者在功能性OCs形成中起著關鍵作用。在破骨前體細胞成為OCs的過程中,Beclin-1通過自身泛素化促進RANKL刺激OCs進行分化[17]。OCs骨吸收功能是通過含有分泌型溶酶體和肌動蛋白環(huán)的褶皺緣來實現(xiàn)的。肌動蛋白環(huán)由足小體形成,褶皺緣可以通過分泌組織蛋白酶K(cathepsinK,CTSK)降解骨基質(zhì)，自噬參與骨吸收過程中肌動蛋白環(huán)和褶皺邊緣的形成。在表達CTSK的細胞中，Beclin-1敲除會損害OCs功能，導致皮質(zhì)骨厚度增加[17]。CTSK受ATG5調(diào)節(jié)，ATG5缺失影響溶酶體關聯(lián)膜蛋白1進入肌動蛋白環(huán)的過程，使得CTSK減少，骨吸收能力受損，而ATG7敲除同樣影響OCs骨吸收功能[18]。蛋白激酶3(Kindlin-3，K3)是足體中必需的接頭蛋白，其缺失導致OCs足體環(huán)功能障礙，K3可以與自噬相關基因LC3Ⅱ相互作用，來調(diào)節(jié)OCs遷移[19]。以上表明自噬相關基因ATG5、ATG7、Beclin-1、LC3Ⅱ均參與到OCs活動，對OCs分化、遷移、骨吸收功能起到重要調(diào)控作用。

2 調(diào)控自噬治療骨質(zhì)疏松癥

調(diào)控自噬治療骨質(zhì)疏松癥的相關策略見圖1。

圖1 不同方式干預自噬治療骨質(zhì)疏松癥策略圖

2.1 調(diào)控自噬影響骨相關細胞功能

2.1.1調(diào)節(jié)自噬促進BMSCs成骨分化：BMSCs功能在OP中起著關鍵作用，老年BMSCs分化為OBs的能力下降，這種變化導致骨形成減少進而導致OP，因此BMSCs的精細調(diào)控對維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要作用[20]。通過激活自噬促進BMSCs成骨分化有利于骨重塑中骨形成增加，協(xié)調(diào)成骨成脂分化平衡。最近的研究[21]發(fā)現(xiàn)，清道夫受體Scara3通過促進Foxo1表達和自噬來促進OVX小鼠骨形成，減少骨髓脂肪積累，并減輕老年小鼠骨丟失，提示通過靶向Scara3來調(diào)節(jié)脂肪細胞與OBs分化之間的轉(zhuǎn)換，是骨丟失和骨質(zhì)疏松的潛在治療靶點。Vidoni等[22]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和成骨誘導因子通過AMPK/Beclin-1途徑協(xié)同激活自噬誘導人牙齦間充質(zhì)干細胞的成骨分化，表明自噬調(diào)節(jié)是促進人牙齦間充質(zhì)干細胞成骨分化的重要手段。

2.1.2調(diào)節(jié)OBs自噬促進骨基質(zhì)礦化：OBs參與的礦化過程是骨組織發(fā)育和代謝中的重要步驟，骨礦化程度也決定了骨的抗壓縮能力的強弱，礦化異常可導致OP等多種疾病。恢復OBs自噬水平可以消除錯誤折疊的骨基質(zhì)蛋白，提高鈣磷結晶運輸效率，促進礦化基質(zhì)產(chǎn)生。最近，一些藥物被證明用于調(diào)節(jié)OBs的自噬水平來促進骨基質(zhì)礦化。例如，熊果苷可改善地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導的小鼠OP，通過激活自噬促進OBs分化和礦化，抑制骨吸收，促進骨形成[23]。硅酸鹽納米粒子C2S NPs通過激活自噬，進而觸發(fā)wnt/β-catenin通路來促進OBs分化和礦化能力[24]。

2.1.3調(diào)節(jié)OCs自噬抑制骨吸收：由于OCs數(shù)量和活性增加，OCs骨吸收增強，導致骨結構受損和骨量降低，這是OP等骨疾病的共同特征，因此調(diào)整自噬抑制OCs分化和骨吸收可能是防治骨丟失的有效手段。例如，丹參-葛根能夠通過調(diào)節(jié)自噬和氧化應激介導的OCs分化來改善OP[25]。熊果酸能夠通過抑制自噬介導的OCs分化，改善骨小梁結構惡化，降低血清OCs特異性細胞因子表達，對卵巢切除術(OVX)大鼠骨質(zhì)疏松有明顯的保護作用，并減輕腎臟損害[26]。

2.1.4延緩細胞衰老、抑制細胞凋亡：衰老是生物體不可避免的，但是通過延緩衰老、預防和治療某些衰老相關疾病如衰老性OP，是完全可行的。在衰老細胞中觀察到自噬水平下降和溶酶體功能障礙，因此，藥物干預自噬可能是一種前瞻性抗細胞衰老的方法。例如在衰老骨組織中,雷帕霉素通過激活骨細胞自噬,減少年齡相關的骨細胞凋亡,使骨吸收和骨形成達到平衡[27]。同樣，激活自噬以維持骨相關細胞活性和防止凋亡是治療OP的有效方法。例如芍藥苷能夠通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR/自噬信號通路，抑制Dex誘導的OBs凋亡，促進細胞活力和骨代謝[28]。

2.2 調(diào)控自噬相關信號通路

2.2.1PI3K/Akt/mTOR信號通路：PI3K/Akt/mTOR信號通路與細胞生長、增殖、壽命等直接相關，目前該通路在OP中調(diào)控自噬的研究最為深入，但仍存在一些疑惑和矛盾。一方面，部分研究[29]通過抑制PI3K/Akt/mTOR，誘導自噬介導BMSCs向OBs分化，促進OBs增殖和礦化，減輕骨細胞凋亡。例如在阿爾茨海默病和OP相關性研究[30]中發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病典型病理產(chǎn)物淀粉樣蛋白-β1-42作為外部刺激直接抑制BMSCs增殖，而抑制Akt/mTOR通路激活自噬可逆轉(zhuǎn)這一效果。另一方面，也有研究[31]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導體內(nèi)OCs自噬增強從而導致骨丟失，而激活該通路則可逆轉(zhuǎn)OCs自噬。這反映出三個問題：一是自噬在OCs中的作用仍不完全明確；二是應該選擇抑制該通路誘導自噬從而促進成骨，還是激活該通路抑制自噬從而減輕骨丟失；三是如何調(diào)節(jié)特定細胞自噬并將這些可行性轉(zhuǎn)化為臨床。

2.2.2NF-κB信號通路：NF-κB蛋白由p65和p50亞單位構成二聚體，并與抑制蛋白IκB結合構成三聚體復合物而處于失活狀態(tài)，當刺激因素激活NF-κB后，磷酸化IKKβ亞基，IκB被置換出來并受到蛋白酶體降解，從而活化NF-κB并使其易位進入細胞核。被激活的NF-κB信號通路可以促進OCs形成與活化，從而增加骨吸收[32]，而NF-κB的失活促進OBs體外分化和體內(nèi)骨形成[33]。NF-κB亦是典型促炎信號通路，有研究發(fā)現(xiàn)[34]ω-3游離脂肪酸通過增強自噬降解炎性復合物從而減輕炎癥，也可抑制NF-κB活化來阻止炎癥啟動，提示NF-κB、自噬與炎癥之間存在著潛在的相互聯(lián)系。

2.2.3MAPK信號通路：MAPK信號通路包含4條分支路線，即ERK、JNK、p38和ERK5。MAPK/ERK通路正調(diào)節(jié)自噬，通過提高自噬保護氧化應激下的骨細胞[35]，并參與破骨前體細胞增殖和OCs凋亡[36]。MAPK/JNK通路常與RANKL信號通路交聯(lián)，參與OCs形成、分化、凋亡過程[37]。MAPK/p38通路則對OCs分化和骨吸收起調(diào)控作用[38]。目前對于MAPK/ERK5通路研究相對匱乏，但明確的是M-CSF可通過誘導ERK5磷酸化來參與OCs分化過程[39]。MAPK通路參與OP中自噬的作用機制復雜，在許多研究中仍存在爭議，如ERK信號通路對BMSCs成骨分化起正向[40]還是負向[41]作用仍然存疑，而且MAPK通路分支功能廣泛，多條通路之間交聯(lián)機制仍未清晰，因此要思考如何在多條通路中起到特異性調(diào)控作用。

2.2.4其他信號通路：除上述信號通路外，AMPK信號通路[42]、Hedgehog信號通路[43]、Wnt/β-catenin信號通路[44]等均介導自噬參與骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，各信號通路間交聯(lián)復雜，其潛在作用機制仍需不斷研究。

2.3 非編碼RNA調(diào)控自噬

非編碼RNA(ncRNA)包括miRNA、lncRNA和circRNA等，在細胞增殖、分化、凋亡和自噬等過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。Jin等[45]基于Ilumina深度測序技術鑒定了260個circRNA、70個lncRNA和13個miRNA在絕經(jīng)后OP患者和健康對照組中差異表達。自噬和miRNA、lncRNA、circRNA都參與骨代謝，而為了挖掘ncRNA與自噬相互關系在OP中的治療作用，需要分析兩者之間的交互作用對骨穩(wěn)態(tài)的影響。有關miRNA與自噬在OP中的關系多體現(xiàn)在miRNA對自噬相關因子或信號通路的調(diào)控作用。例如，miRNA-20a可通過靶向RAW264.7細胞中HIF-1α顯著下調(diào)自噬標志物(LC3、p62、Atg5、Atg12、Atg7、Beclin-1等)，這是缺氧誘導的OCs分化的關鍵機制[46]。miRNA-378通過影響PI3K/Akt通路降低OBs活力和礦化能力[47]。lncRNA和circRNA都可以通過直接與miRNA結合而影響OP進程，并與自噬密切相關，但目前有關circRNA和lncRNA的研究還比較表淺。Ji等[48]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 002682通過miRNA-188-3p靶向上調(diào)Beclin-1介導的自噬，從而促進OBs分化。Wu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZFAS1通過上調(diào)miRNA-499上調(diào)EPHA5表達從而抑制BMSCs成骨分化，且ZFAS1敲除會促進成骨分化，抑制脂肪分化，促進細胞自噬，抑制細胞衰老，表明ZFAS1/miR-499/EPHA5途徑可能在BMSCs成骨和成脂之間的相關轉(zhuǎn)換中起重要作用。ncRNA在骨組織中的生物學作用至關重要，針對其與自噬的相互作用來治療OP在臨床中的應用潛力無疑是巨大的，ncRNA/自噬模擬物或ncRNA/自噬抑制劑的研發(fā)可能是有效預防骨丟失的治療方法。

3 討論與展望

自噬在OP中扮演著復雜的角色，在不同類型、程度的OP中，自噬的抑制或激活程度、功能均不同。調(diào)節(jié)自噬的方式也是復雜多樣的，從自噬影響不同骨相關細胞的功能、自噬相關信號通路的信息傳遞、非編碼RNA與自噬的相互作用等多種方式，均能使合適的自噬水平參與骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，進一步影響OP發(fā)生發(fā)展。但顯然多種方式又是互相交聯(lián)的，特異性靶向調(diào)節(jié)而不影響其他細胞過程仍然存在挑戰(zhàn)。骨重塑過程是動態(tài)的，自噬也是動態(tài)的，提示需要更好的監(jiān)測自噬與OP的動態(tài)關系。這無疑是困難的，但對于加快推進分子機制的研究和藥物的研發(fā)具有極大的指導意義。