MEK1/2抑制劑曲美替尼對體外多房棘球蚴原頭節的作用研究

李德偉，施 陽，李 亮，侯昕伶，王 慧， 張傳山，李 靜

泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)為一種慢性地方性寄生蟲病，主要寄生于肝臟，呈浸潤性生長[1-2]。據報道，未治療的AE患者10～15年后死亡率高達90%[1]。多年來，AE患者主要采用手術與藥物相結合的治療方式控制疾病進展與復發，但使用常用藥物阿苯達唑與甲苯達唑治療只抑制寄生蟲生長而非有效殺死寄生蟲，同時，部分患者還會產生嚴重不良反應，如肝毒性[2-4]。產生肝毒性的患者只能被迫中斷藥物治療，導致后續復發率相對較高[3]。因此，輔助手術治療的藥物亟待改進。

經研究，多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，Em)在肝臟寄生，其發育微環境與宿主表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)有關[5]；當宿主EGF與Em的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)結合，將激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路之一的MEK/ERK信號通路，并依次通過激活MAPK激酶激酶(MAPK kinase kinase，MEKK)、MAPK激酶(MAPK kinase，MEK)及MAPK的方式，驅動信號由細胞表面傳遞到細胞核內，調節細胞增殖、分化與應激反應，進而加速蟲體生長發育[4-7]，推測抑制該通路可抑制蟲體的發育進程。因此，本試驗以1、50、100 μmol/L的MEK1/2抑制劑曲美替尼(trametinib)進行體外干預多房棘球蚴原頭節實驗，從蟲體形態、活性和表面超微結構觀察曲美替尼的作用效果，并輔以同源建模，討論基于曲美替尼靶向治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原頭節 取自新疆醫科大學動物實驗中心提供的感染Em的沙鼠肝臟。

1.1.2 主要試劑 曲美替尼(GSK-1120212，Batch No.S267309)購自美國Selleck公司。

1.1.3 倫理批準和患者知情同意 該試驗獲新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(批準號：20140411-05)，不涉及患者知情同意。

1.2 方 法

1.2.1 取材 病灶取自經腹腔注射Em感染3個月的沙鼠模型。分離并研磨病灶后取混合液于離心管，PBS反復清洗病灶研磨后的混合液。

1.2.2 培養 棄上清，加入足量培養基(1%雙抗、10% FBS、RPMI 1640)，于CO2培養箱中培養3 d后待用。

1.2.3 體外干預 DMSO室溫溶解曲美替尼，根據文獻[4]的方法建立空白對照組、DMSO組及1、50、100 μmol/L曲美替尼干預組。按照每組3孔，每孔300原頭節/200 μL培養液的方式加入96孔板，CO2培養箱中培養3 d、6 d、9 d、12 d，3 d換液1次。

1.2.4 活性檢測 取各時間段各組原頭節，伊紅染色10 min后鏡下統計原頭節活性情況。

1.2.5 表面超微結構觀察 取12 d各組原頭節，經成像前處理(固定、脫水、干燥及噴金)后SEM觀察原頭節表面超微結構。

1.2.6 Em MEK1/2同源建模 從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/)查詢Em的MEK1/2氨基酸序列，Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org)進行同源建模，構建Em MEK1/2分子三級結構并根據文獻[8-9]的方法比較與人MEK1/2分子的同源性。

1.2.7 統計學方法 數據處理使用SPSS 25.0，分別采用單因素方差分析和配對t檢驗進行組間和組內差異性比較，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 曲美替尼體外干預后原頭節活性變化 原頭節活性變化及差異性分析見圖1及表1。隨著干預時間的延長，1 μmol/L曲美替尼干預3 d、6 d、9 d原頭節活性并無明顯變化，其活性分別為(84.72±0.27)%、(87.32±2.01)%、(85.12±3.64)%；而干預至12 d時，原頭節活性(37.82±2.12)%較9 d突然出現轉折式下降(t=15.87，P<0.01)。同樣，干預6 d時100 μmol/L曲美替尼組原頭節活性(2.13±0.10)%較3 d時(10.30±3.82)%下降(t=33.75，P<0.01)，干預9 d時50 μmol/L曲美替尼組原頭節活性(3.86±3.97)%較6 d時(47.48±3.11)%下降(t=12.22，P<0.01)。隨著干預濃度的增加，50 μmol/L與100 μmol/L曲美替尼組干預12 d原頭節活性分別為(1.62±0.43)%、(0.00±0.00)%，原頭節活性被抑制。蟲體活性與作用濃度和時間成反比，且蟲體活性被抑制的關鍵節點隨干預濃度的增加而提前。

表1 曲美替尼作用原頭節存活率Tab.1 Protoscolex survival rate under trametinib treatment

2.2 曲美替尼體外干預后原頭節形態變化 空白對照組與DMSO組原頭節均為外翻型，頂突結構正常，小鉤大部分排列整齊，4個吸盤分布有序，整體結構比例均衡，活性良好(圖2A-B)；1 μmol/L曲美替尼組原頭節部分紅染，染色始于頭部并蔓延至整個蟲體，頭尾比例失調，但仍可見部分排列整齊的小鉤(圖2C)；50 μmol/L 曲美替尼組原頭節紅染數量較1 μmol/L曲美替尼組高，周圍散落小鉤增加；100 μmol/L曲美替尼組原頭節頭部結構損壞嚴重，吸盤結構明顯不可見，蟲體已無活性(圖2D)。隨著干預濃度的增加，蟲體活性逐漸降低，結構畸形和分解的程度也逐漸加重。

2.3 曲美替尼體外干預后原頭節表面超微結構變化 空白對照組蟲體結構完整，吸盤對稱分布且中央內陷(圖3A)；DMSO組蟲體頂突小鉤及體表被微絨毛充分包裹且分布均勻、密集(圖3B)；100 μmol/L曲美替尼組蟲體結構嚴重損壞，微絨毛聚集，體表暴露，小鉤具有脫落趨勢且部分頂突與體表嚴重分離(圖3C-D)。

2.4E.multilocularisMEK1/2三級結構預測 NCBI查詢Em MEK1/2氨基酸序列登錄號分別為FN434110.1和FN434111.1。Swiss Model構建Em MEK1/2分子三級結構(圖4)。與人MEK1模板4an2.1.A和MEK2模板1s9i.1.B相比，序列相似度分別為38.43%和49.67%，GMQE值分別為0.58和0.43，表明Em MEK1/2與人MEK1/2分子具有同源性。二者同源性雖然不高，但提示可以設計高特異性針對Em抗原表位的抗體。

3 討 論

我國在抗包蟲病方面近年來已具有一套完善的診斷、手術及術后藥物治療方案，但術后藥物的選擇目前仍面臨諸多難題[10]。在宿主-寄生蟲共同進化的過程中，宿主利用自身各種免疫機制去清除寄生蟲，蟲體則通過自身基因組多樣化和逃避宿主的免疫應答形成寄生。研究表明，蟲體成功寄生的關鍵因素與宿主先天免疫功能以及信號通路有關，如MAPK信號通路[11-14]。該通路包括P38 MAPK、JNK與MAPK/ERK等分支，對寄生蟲與宿主間的相互作用具有重要意義，如影響細胞分化、增殖、凋亡等功能[11-12]。抑制相應的MAPK信號通路可降低寄生蟲的致病性及侵襲能力，如低濃度p38 MAPK抑制劑SB202190在不影響人細胞p38蛋白激酶的活性的同時可有效抑制Em生長發育[14-15]；JNK抑制劑SP600125通過抑制JNK信號誘導細粒棘球蚴原頭節凋亡[14]。同時，報道發現Em存在的EGFR可與宿主EGF結合，激活EGFR介導的MAPK/ERK信號通路，導致蟲體發育迅速[4,16-19]。MEK作為該通路重要的信號分子，將為AE治療帶來新的途徑。

Em存在一群多功能干細胞(neoblasts)，具有強大的自我更新能力，是Em在宿主體內生長發育需具備的基本條件之一，也是整個生命周期中細胞增殖的唯一來源[16-17]。維持這群細胞的功能需要不斷利用細胞外源信號引發內在信號級聯反應來實現[16-17]。EGFR作為MEK/ERK信號通路上游調控分子，在干細胞的維持和調節中具有重要作用[16-19]。當蟲體EGFR與宿主來源的EGF結合，細胞質酪氨酸激酶被激活并驅動尾部酪氨酸殘基磷酸化，誘導生長因子受體結合蛋白2(GRB2)分子復合物到達細胞膜激活RAS，活化的RAS通過磷酸化等激活被募集在細胞膜上的RAF，從而直接調節MEK1/2，導致下游信號ERK1/2磷酸化并進入細胞核調節細胞生長的相關基因轉錄，使Em迅速增殖[16,19-20]。目前，尚不清楚EGFR/ERK信號促進增殖的作用是Em干細胞的直接反應，還是其分化細胞在宿主EGF刺激下產生第二信號的間接反應[16]，仍待進一步研究。

曲美替尼作為高特異性MEK1/2抑制劑，用于腫瘤患者治療往往產生劑量限制性毒性作用，如皮疹、腹瀉甚至中心性漿液性視網膜病變，而劑量低于2 mg/d其毒副作用可被有效控制[21]，且對ERK1/2的激酶活性沒有抑制作用。實驗發現，1 μmol/L(0.123 mg/d)曲美替尼體外作用于Em可破壞蟲體結構、影響蟲體活性，對原頭節活性的抑制作用高于另一種MEK1/2抑制劑(U0126)[4]；50、100 μmol/L(6.15 mg/d、12.3 mg/d)體外對蟲體活性的抑制作用極強，但該劑量用于臨床治療將產生嚴重的藥物毒性作用[21]。另外，Em感染早期ERK1/2和下游靶點如細胞周期蛋白A(Cyclin A)等激活可促進肝細胞增殖并介導其抗凋亡反應，減少肝組織損傷，但過度激活將導致患者肝臟異常腫大[22]，嚴重危害肝臟功能。綜合分析本實驗及前期研究結果，提示低劑量曲美替尼治療可良好抑制蟲體活性，且在不影響肝臟自身發揮保護作用的同時，還可有效防止肝臟腫大，為其作為抗Em靶點提供了可靠依據。

程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)作為重要的免疫抑制分子，與配體結合將抑制T細胞活化[23]。已有研究表明，其抑制劑聯合曲美替尼治療將協同恢復T細胞功能，增強患者抗腫瘤反應[23]。因此，低劑量曲美替尼與PD-1抑制劑的聯合運用可能彌補曲美替尼具有劑量限制性毒性的缺點，這將為探索包蟲病防治新途徑提供重要思路。

利益沖突：無

引用本文格式：李德偉，施陽，李亮，等. MEK1/2抑制劑曲美替尼對體外多房棘球蚴原頭節的作用研究[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(8)：673-677. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.105